میتابۆلیتە بەرگریگۆڕینەکان تایبەتمەندییەکی سەرەکی ژینگەی بچووکی وەرەمن (TME)، بەڵام بە چەند ئیستسنایەک، ناسنامەکانیان تاڕادەیەکی زۆر نادیارە. لێرەدا، ئێمە وەرەم و خانەکانی Tمان لە وەرەم و ئاسیتی نەخۆشانی تووشبوو بە شێرپەنجەی سیرۆسی پلە بەرز (HGSC) شیکردەوە بۆ ئاشکراکردنی میتابۆلۆمی ئەم بەشە جیاوازانەی TME. ئاسیت و خانەکانی وەرەم جیاوازییەکی بەرفراوانی میتابۆلیتەیان هەیە. بە بەراورد لەگەڵ ئاسیت، خانەکانی T دزەپێکەری وەرەم بە شێوەیەکی بەرچاو دەوڵەمەندن بە 1-میثیلنیکۆتینامید (MNA). هەرچەندە ئاستی MNA لە خانەکانی T بەرز دەبێتەوە، بەڵام دەربڕینی نیکۆتینامید N-methyltransferase (ئەنزیمێک کە کاتالیزەکردنی گواستنەوەی گروپەکانی میتیل لە S-adenosylmethionine بۆ نیکۆتینامید) سنووردارە بە ڕیشاڵە گەورەکان و خانەکانی وەرەم. لە ڕووی کاراییەوە، MNA خانەکانی T هان دەدات بۆ دەردانی سایتاکینەکانی پەرەپێدانی وەرەمی فاکتەری نەکرۆزی وەرەمی ئەلفا. بۆیە، MNA وەرگیراو لە TME بەشدارە لە ڕێکخستنی بەرگری خانەکانی T و نوێنەرایەتی ئامانجێکی چارەسەری بەرگری پۆتانسێل دەکات بۆ چارەسەرکردنی شێرپەنجەی مرۆڤ.
میتابۆلیتە وەرگیراوەکانی وەرەم دەتوانن کاریگەرییەکی قووڵی ڕێگریکردنیان هەبێت لەسەر بەرگری دژە وەرەمی، و بەڵگەی زیاتر و زیاتر نیشان دەدەن کە دەتوانن وەک هێزێکی بزوێنەری سەرەکی بۆ پێشکەوتنی نەخۆشیەکەش کاربکەن (1). جگە لە کاریگەری واربورگ، کارەکانی ئەم دواییە دەستیان پێکردووە بۆ تایبەتمەندکردنی دۆخی گۆڕانکاری خانەکانی وەرەم و پەیوەندییەکەی لەگەڵ دۆخی بەرگری ژینگەی بچووکی وەرەم (TME). توێژینەوەکان لەسەر مۆدێلی مشک و خانەکانی T مرۆڤ دەریانخستووە کە میتابۆلیزمی گلوتامین (2)، میتابۆلیزمی ئۆکسجینی (3) و میتابۆلیزمی گلوکۆز (4) دەتوانن بە شێوەیەکی سەربەخۆ کاربکەن لەسەر ژێر گروپە جیاوازەکانی خانەکانی بەرگری. چەندین میتابۆلیت لەم ڕێگایانەدا ڕێگری لە کارکردنی دژە وەرەمی خانەکانی T دەکەن. سەلمێنراوە کە گەمارۆدانی هاوئەنزیمی تێتراهایدرۆبایۆپتێرین (BH4) دەتوانێت زیان بە زیادبوونی خانەکانی T بگەیەنێت، و زیادبوونی BH4 لە جەستەدا دەتوانێت وەڵامی بەرگری دژە وەرەمی بە ناوبژیوانی CD4 و CD8 بەرز بکاتەوە. سەرەڕای ئەوە، دەتوانرێت کاریگەری سەرکوتکەری بەرگری کینورینین بە بەڕێوەبردنی BH4 ڕزگار بکرێت (5). لە گلیۆبلاستۆمای گۆڕاوی ئایزۆسایترات دیهایدرۆجیناز (IDH)دا، دەردانی ئینانتیۆمتابۆلیک (R)-2-هایدرۆکسی گلوتارات (R-2-HG) چالاکبوونی خانەی T، زیادبوون و چالاکیی سایتۆلیسیس ناهێڵێت (6). لەم دواییانەدا، دەرکەوتووە کە میتیلگلیۆکسال، بەرهەمێکی لاوەکی گلایکۆلیسیس، لەلایەن خانە سەرکوتکەرەکانی سەرچاوەی مایلۆیدەوە بەرهەمدەهێنرێت، و گواستنەوەی خانەی T ی میتیلگلیۆکسال دەتوانێت کارکردنی خانەی T کاریگەر ڕێگری بکات. لە چارەسەرکردندا، بێلایەنکردنی میتیلگلیۆکسال دەتوانێت چالاکیی خانە سەرکوتکەرەکانی وەرگیراو لە مایلۆید (MDSC) زاڵ بێت و بە شێوەیەکی هاوبەش چارەسەری گەمارۆدانی خاڵەکانی پشکنین لە مۆدێلی مشکدا بەرز بکاتەوە (7). ئەم توێژینەوەیانە بەکۆمەڵ جەخت لەسەر ڕۆڵی سەرەکی میتابۆلیتە وەرگیراوەکانی TME دەکەنەوە لە ڕێکخستنی کارکردن و چالاکیی خانەکانی T.
تێکچوونی کارکردنی خانەکانی T بە شێوەیەکی بەرفراوان لە شێرپەنجەی هێلکەداندا ڕاپۆرت کراوە (8). ئەمەش بەشێکی دەگەڕێتەوە بۆ تایبەتمەندییە گۆڕانکارییەکانی ناو کەمی ئۆکسجین و نائاسایی بۆرییەکانی وەرەم (9)، کە لە ئەنجامدا دەبێتە هۆی گۆڕینی گلوکۆز و تریپتۆفان بۆ بەرهەمی لاوەکی وەک ترشی لاکتیک و کینورینین. زیادەڕۆیی لە لاکتاتی دەرەوەی خانەیی بەرهەمهێنانی ئینتەرفیرۆن-γ (IFN-γ) کەمدەکاتەوە و جیاکردنەوەی ژێر گروپە سەرکوتکەرەکانی مایلۆسپرێسیڤ دەباتە پێشەوە (10، 11). خواردنی تریپتۆفان ڕاستەوخۆ ڕێگری دەکات لە زیادبوونی خانەی T و ڕێگری دەکات لە ئاماژەدانی وەرگری خانەی T (12-14). سەرەڕای ئەم تێبینیانە، کارێکی زۆر لە دەوری میتابۆلیزمی بەرگری لە ناو ئامێری پشکنیندا ئەنجامدرا لە کشتوکاڵی خانەی T بە بەکارهێنانی میدیای باشتر، یان سنووردار بە مۆدێلی مشکی هاوشێوە لە ناو جەستەدا، کە هیچ کامیان بە تەواوی ڕەنگدانەوەی نایەکسانی شێرپەنجەکانی مرۆڤ و ژینگەی فیزیۆلۆژی ماکرۆ و مایکرۆ نین.
تایبەتمەندییەکی باوی شێرپەنجەی هێلکەدان بریتییە لە بڵاوبوونەوەی زراو و دەرکەوتنی ئاسیت. کۆبوونەوەی شلەی خانەکان لە ئاسیتدا پەیوەندی بە نەخۆشی پێشکەوتوو و پێشبینی خراپەوە هەیە (15). بەپێی ڕاپۆرتەکان، ئەم بەشە ناوازەیە کەم ئۆکسجینە، ئاستی بەرزی فاکتەری گەشەی ناوپۆشی خوێنبەرەکان (VEGF) و ئیندۆلیامین 2،3-دایۆکسیجیناز (IDO)ی هەیە، و لەلایەن خانە ڕێکخەرەکانی T و خانە ڕێگریکەرەکانی مایلۆیدەوە دزە دەکرێت (15-18). ڕەنگە ژینگەی گۆڕانکارییەکانی ئاسیت جیاواز بێت لە خودی وەرەمەکە، بۆیە دووبارە بەرنامەدانانی خانەکانی T لە بۆشایی زراودا ڕوون نییە. جگە لەوەش، جیاوازییە سەرەکییەکان و نایەکسانی نێوان ئاسیت و میتابۆلیتەکان کە لە ژینگەی وەرەمدا هەن، ڕەنگە ڕێگری لە دزەکردنی خانەکانی بەرگری و کارکردنیان لەسەر وەرەمەکان بکەن و لێکۆڵینەوەی زیاتر پێویستە.
بۆ چارەسەرکردنی ئەم کێشانە، ئێمە شێوازێکی هەستیارمان داڕشت بۆ جیاکردنەوەی خانەکان و کرۆماتۆگرافی شلە تاندێم سپێکترۆمێتری بارستەیی (LC-MS/MS) بۆ لێکۆڵینەوە لە جۆرە جیاوازەکانی خانە (لەوانەش خانەکانی CD4 + و CD8 + T) هەروەها لەناو و لە نێوان وەرەمەکاندا میتابۆلیتەکانی خانەکانی هەمان ئاسیت و ژینگەی وەرەمی نەخۆشەکە دەگرێتەوە. ئێمە ئەم ڕێگایە بە هاوبەشی لەگەڵ خانەپێوانی لێشاوی ڕەهەندی بەرز و ڕێکخستنی RNAی تاکە خانەیی (scRNA-seq) بەکاردەهێنین بۆ دابینکردنی پۆرترێتێکی زۆر چارەسەرکراوی دۆخی گۆڕانکارییەکانی ئەم دانیشتووانە سەرەکییانە. ئەم شێوازە زیادبوونی بەرچاوی ئاستی 1-methylnicotinamide (MNA) لە خانەکانی T وەرەمدا ئاشکرا کرد، و تاقیکردنەوەکانی ناو ئامێری پشکنینی دەرەکی دەریانخست کە کاریگەری بەرگری گۆڕینی MNA لەسەر کارکردنی خانەکانی T پێشتر نەزانرابوو. بەگشتی، ئەم شێوازە کارلێکە گۆڕانکارییە هاوبەشەکانی نێوان وەرەم و خانەکانی بەرگری ئاشکرا دەکات، و تێڕوانینێکی ناوازە لە میتابۆلیتەکانی ڕێکخستنی بەرگری دەدات، کە ڕەنگە بۆ چارەسەرکردنی چارەسەری بەرگری شێرپەنجەی هێلکەدان لەسەر بنەمای خانەی T دەرفەتەکانی چارەسەرکردن بەسوود بێت.
ئێمە خانەپێوانی لێشاوی ڕەهەندی بەرزمان بەکارهێنا بۆ لە هەمان کاتدا ژماردن و دیاریکردنی وەرگرتنی گلوکۆز [2-(N-(7-نایترۆفینێل-2-ئۆکسا-1،3-دیازا-4-یل)ئەمینۆ)-2-دیۆکسی گلوکۆز (2-NBDG) و چالاکیی مایتۆکۆندریال [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7، 19، 20) شانبەشانی یەکترن نیشاندەرەکان کە خانەکانی بەرگری و دانیشتوانی خانەکانی وەرەم جیا دەکەنەوە (خشتەی S2 و وێنەی S1A). ئەم شیکارییە دەریخست کە بە بەراورد لەگەڵ خانەکانی T، خانەکانی ئاسیت و وەرەم ئاستی وەرگرتنی گلوکۆزیان بەرزترە، بەڵام جیاوازییەکی بچووکتریان هەیە لە چالاکیی مایتۆکۆندریالەکاندا. تێکڕای وەرگرتنی گلوکۆزی خانەکانی وەرەم [CD45-EpCAM (EpCAM)+] سێ بۆ چوار هێندەی خانەکانی T یە، و تێکڕای وەرگرتنی گلوکۆزی خانەکانی CD4 + T 1.2 هێندەی خانەکانی CD8 + T یە، ئەمەش ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە لیمفۆسایتی دزەپێکەری وەرەمی (TIL) پێویستی گۆڕانکاری جیاوازیان هەیە تەنانەت لە هەمان TME (شێوەی 1A). لە بەرامبەردا، چالاکیی مایتۆکۆندریال لە خانەکانی وەرەمدا هاوشێوەی خانەکانی CD4 + T یە، و چالاکیی مایتۆکۆندریاڵی هەردوو جۆری خانەکە زیاترە لە خانەکانی CD8 + T (شێوەی 1B). بەگشتی ئەم ئەنجامانە ئاستی گۆڕانکاری خۆراک ئاشکرا دەکەن. چالاکیی گۆڕانکارییەکانی خانەکانی وەرەم زیاترە لە خانەکانی CD4 + T، چالاکیی گۆڕانکارییەکانی خانەکانی CD4 + T زیاترە لە خانەکانی CD8 + T. سەرەڕای ئەم کاریگەریانە لە سەرانسەری جۆرەکانی خانەدا، هیچ جیاوازییەکی بەردەوام لە دۆخی گۆڕانکارییەکانی خانەکانی CD4 + و CD8 + T یان ڕێژەی ڕێژەیییان لە ئاسیتەکاندا بە بەراورد لەگەڵ وەرەمەکاندا نییە (شێوەی 1C). لە بەرامبەردا، لە بەشە خانەی CD45، ڕێژەی خانەکانی EpCAM+ لە وەرەمەکەدا زیادی کردووە بە بەراورد لەگەڵ ئاسیت (شێوەی 1D). هەروەها جیاوازییەکی ڕوونی میتابۆلیکیمان لە نێوان پێکهاتەکانی خانەی EpCAM+ و EpCAM-دا بەدیکرد. خانەکانی EpCAM+ (وەرەمی) وەرگرتنی گلوکۆز و چالاکیی مایتۆکۆندریالیان زیاترە لە خانەکانی EpCAM-، کە زۆر زیاترە لە چالاکیی گۆڕانکارییەکانی ڕیشاڵە گەورەکان لە خانەکانی وەرەم لە TME (شێوەی 1، E و F).
. (C) ڕێژەی خانەکانی CD4 + و CD8 + (لە خانەکانی CD3 + T) لە ئاسیت و وەرەمدا. (D) ڕێژەی خانەکانی وەرەمی EpCAM + لە ئاسیت و وەرەمدا (CD45−). (E و F) وەرگرتنی گلوکۆزی EpCAM + CD45-tumor و EpCAM-CD45-matrix (2-NBDG) (E) و چالاکیی مایتۆکۆندریال (MitoTracker سووری تۆخ) (F) گرافیکی نوێنەری (چەپ) و زانیاری خشتەی (ڕاست) ئاسیت و خانەکانی وەرەم. (G) گرافیکی نوێنەری دەربڕینی CD25، CD137 و PD1 بە ڕێگەی خانەپێوانی لێشاو. (H و I) دەربڕینی CD25، CD137 و PD1 لەسەر خانەکانی CD4 + T (H) و خانەکانی CD8 + T (I). (J و K) فینۆتایپی نایڤ، بیرەوەری ناوەندی (Tcm)، کاریگەر (Teff) و بیرەوەری کاریگەر (Tem) لەسەر بنەمای دەربڕینی CCR7 و CD45RO. وێنەی نوێنەرایەتی (چەپ) و زانیاری خشتەیی (ڕاست)ی خانەکانی CD4 + T (J) و خانەکانی CD8 + T (K) لە ئاسیت و وەرەمەکاندا. بەهاکانی P کە بە تاقیکردنەوەی t جووتە دیاریکراون (*P<0.05، **P<0.01 و ***P<0.001). هێڵەکە نوێنەرایەتی نەخۆشە هاوتاکان دەکات (n = 6). FMO، فلۆرۆسەنس کەمکردنەوەی یەک؛ MFI، مامناوەندی چڕی فلۆرۆسەنس.
شیکاری زیاتر جیاوازی بەرچاوی دیکەی لە نێوان دۆخی فینۆتایپی خانەی T ی زۆر چارەسەرکراودا ئاشکرا کرد. یادەوەری چالاککراو (شێوەی 1، G بۆ I) و کاریگەر (شێوەی 1، J و K) لە وەرەمەکاندا زۆر زیاترە لە ئاسیت (رێژەی خانەکانی CD3 + T). بە هەمان شێوە، شیکردنەوەی فینۆتایپ بە دەربڕینی نیشاندەری چالاکبوون (CD25 و CD137) و نیشاندەری کەمبوونەوە [پڕۆتینی مردنی خانە بەرنامەبۆداڕێژراو 1 (PD1)] دەریخست کە هەرچەندە تایبەتمەندییە گۆڕانکارییەکانی ئەم دانیشتووانە جیاوازن (شێوەی S1، B بۆ E) , بەڵام هیچ جیاوازییەکی میتابۆلیکی بەرچاو بە بەردەوامی لە نێوان ژێرکۆمەڵەکانی بێهەڵوێست، کاریگەر یان بیرەوەریدا بەدی نەکرا (شێوەی S1، F بۆ I). ئەم ئەنجامانە بە بەکارهێنانی ڕێگاکانی فێربوونی ئامێر پشتڕاستکرانەوە بۆ تەرخانکردنی ئۆتۆماتیکی فینۆتایپی خانەکان (21)، کە زیاتر بوونی ژمارەیەکی زۆر لە خانەکانی مۆخی ئێسک (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) لە ئاسیتی نەخۆشەکەدا ئاشکرا کرد (شێوەی S2A). لە نێوان هەموو جۆرەکانی خانە دەستنیشانکراوەکان، ئەم دانیشتووانەی خانە مایلۆیدەکان بەرزترین وەرگرتنی گلوکۆز و چالاکیی مایتۆکۆندریالیان نیشان دا (شێوەی S2، B تا G). ئەم ئەنجامانە جیاوازییە بەهێزەکانی میتابۆلیکی نێوان چەندین جۆری خانە کە لە ئاسیت و وەرەمدا لە نەخۆشانی HGSCدا دەبینرێن، دەردەخەن.
تەحەدای سەرەکی لە تێگەیشتن لە تایبەتمەندییە میتابۆنۆمیەکانی TIL پێویستی جیاکردنەوەی نمونەی خانەکانی T بە پاکی و کوالیتی و بڕی پێویست لە وەرەمەکانە. توێژینەوە نوێیەکان دەریانخستووە کە شێوازەکانی ڕیزکردن و دەوڵەمەندکردنی کۆپەڵە لەسەر بنەمای خانەپێوانی لێشاو لەوانەیە ببێتە هۆی گۆڕانکاری لە پرۆفایلی میتابۆلیتە خانەییەکان (22-24). بۆ زاڵبوون بەسەر ئەم کێشەیە، ئێمە شێوازی دەوڵەمەندکردنی کۆپەڵەکانمان باشتر کرد بۆ جیاکردنەوە و جیاکردنەوەی TIL لە شێرپەنجەی هێلکەدانی مرۆڤی نەشتەرگەری بڕاو پێش شیکاری بە LC-MS/MS (بڕوانە کەرەستە و شێوازەکان؛ وێنەی 2A). بۆ هەڵسەنگاندنی کاریگەری گشتی ئەم پرۆتۆکۆڵە لەسەر گۆڕانکارییەکانی میتابۆلیت، ئێمە پرۆفایلی میتابۆلیتی خانەکانی T کە لەلایەن بەخشەرە تەندروستەکانەوە چالاککراون دوای هەنگاوی جیاکردنەوەی کۆپەڵەی سەرەوە بەراوردمان کرد لەگەڵ ئەو خانانەی کە بە کۆپەڵ جیا نەکرابوونەوە بەڵام لەسەر سەهۆڵ مابوونەوە. ئەم شیکارییە کۆنترۆڵی کوالیتییە دەریخست کە پەیوەندییەکی بەرز لە نێوان ئەم دوو بارودۆخەدا هەیە (r = 0.77)، و دووبارەبوونەوەی تەکنیکی گروپی 86 میتابۆلیت دووبارەبوونەوەی بەرزی هەیە (شێوەی 2B). بۆیە ئەم ڕێگایانە دەتوانن شیکاری وردی میتابۆلیتەکان لە خانەکانی دەوڵەمەندکردنی جۆری خانەدا ئەنجام بدەن، بەم شێوەیە یەکەم سەکۆی ڕوونی بەرز بۆ ناسینەوەی میتابۆلیتە تایبەتەکان لە HGSC دابین دەکەن، بەمەش خەڵک دەتوانن تێگەیشتنێکی قووڵتر لە تایبەتمەندی خانەکان بەدەستبهێنن بەرنامەی میتابۆلیزمی سێکسی.
(A) دیاگرامی نەخشەیی دەوڵەمەندکردنی کۆپەڵە موگناتیسیەکان. پێش شیکاری بە LC-MS/MS، خانەکان سێ خولی یەک لە دوای یەک لە دەوڵەمەندکردنی کۆپەڵە موگناتیسیەکان تێدەپەڕن یان لەسەر سەهۆڵ دەمێننەوە. (B) کاریگەری جۆری دەوڵەمەندکردن لەسەر زۆری میتابۆلیتەکان. تێکڕای سێ پێوانە بۆ هەر جۆرێکی دەوڵەمەندکردن ± SE. هێڵی خۆڵەمێشی نوێنەرایەتی پەیوەندییەکی 1:1 دەکات. پەیوەندی نێوان پۆلەکان (ICC)ی پێوانە دووبارەبووەکان کە لە ناوی میحوەرەکەدا نیشان دراوە. NAD، نیکۆتینامید ئەدینین دینۆکلیۆتاید. (C) دیاگرامی نەخشەیی ڕەوتی کاری شیکاری میتابۆلیتی نەخۆش. ئاسیت یان وەرەم لە نەخۆشەکان کۆدەکرێنەوە و لە بەستوودا دەپارێزرێن. بەشێکی کەم لە هەر نمونەیەک بە ڕێگەی خانەپێوانی لێشاو شیکرایەوە، لە کاتێکدا نمونەکانی دیکە سێ خولی دەوڵەمەندکردنیان بۆ خانەکانی CD4+، CD8+ و CD45- ئەنجامدا. ئەم بەشە خانانە بە بەکارهێنانی LC-MS/MS شیکرانەوە. (D) نەخشەی گەرمی زۆری میتابۆلیتە ستانداردەکان. دێندرۆگرام نوێنەرایەتی کۆکردنەوەی مەودای ئیوکلیدی نێوان نمونەکان دەکات لەلایەن واردەوە. (E) شیکاری پێکهاتەی سەرەکی (PCA)ی نەخشەی میتابۆلیتە نمونەییەکان، کە سێ دووبارەبوونەوەی هەر نمونەیەک نیشان دەدات، نمونەکانی هەمان نەخۆش بە هێڵێک بەستراوەتەوە. (F) PCA ی پرۆفایلی میتابۆلیتی نمونەکە کە لەسەر نەخۆشەکە مەرجدار کراوە (واتە، بە بەکارهێنانی زیادەڕۆیی بەشەکی)؛ جۆری نمونەکە بەهۆی ناوپۆشی چەقاوە سنووردارە. PC1، پێکهاتەی سەرەکی 1؛ PC2، پێکهاتەی سەرەکی 2.
دواتر، ئێمە ئەم شێوازە دەوڵەمەندکردنەمان بەکارهێنا بۆ شیکردنەوەی 99 میتابۆلیت لە بەشەکانی خانەی CD4 +، CD8 + و CD45 لە ئاسیت و وەرەمی سەرەتایی شەش نەخۆشی HGSC (شێوەی 2C، وێنەی S3A و خشتەی S3 و S4). دانیشتوانی سەرنجڕاکێش 2% بۆ 70%ی نمونەی گەورەی سەرەتایی خانە زیندووەکان پێکدەهێنن و ڕێژەی خانەکان لە نێوان نەخۆشەکاندا زۆر جیاوازە. دوای جیاکردنەوەی کۆپەڵەکان، بەشە دەوڵەمەندکراوەکەی بەرژەوەندی (CD4+، CD8+ یان CD45-) زیاتر لە 85%ی هەموو خانە زیندووەکانی ناو نمونەکە بە تێکڕا پێکدەهێنێت. ئەم شێوازە دەوڵەمەندکردنە ڕێگەمان پێدەدات کە دانیشتوانی خانەکان لە میتابۆلیزمی شانەکانی وەرەمی مرۆڤەوە شی بکەینەوە، کە ئەمەش مەحاڵە لە نمونەی گەورەوە ئەنجام بدرێت. بە بەکارهێنانی ئەم پرۆتۆکۆڵە، ئێمە دیاریمان کرد کە l-kynurenine و adenosine، ئەم دوو میتابۆلیتە بەرگری سەرکوتکەرەی کە بە باشی تایبەتمەندکراون لە خانەکانی T وەرەمی یان خانەکانی وەرەمدا بەرزبوونەتەوە (شێوەی S3، B و C). بۆیە ئەم ئەنجامانە دڵسۆزی و توانای تەکنەلۆژیای جیاکردنەوەی خانەکانمان و سپێکترۆمێتری بارستەییمان بۆ دۆزینەوەی میتابۆلیتە گرنگەکانی بایۆلۆژی لە شانەکانی نەخۆشدا نیشان دەدەن.
هەروەها شیکارییەکانمان جیابوونەوەیەکی بەهێزی میتابۆلیکی جۆرەکانی خانەکانی ناو و لە نێوان نەخۆشەکاندا ئاشکرا کرد (شێوەی 2D و وێنەی S4A). بە تایبەتی، بە بەراورد لەگەڵ نەخۆشەکانی تر، نەخۆشی 70 تایبەتمەندی گۆڕانکاری جیاوازی نیشان دا (شێوەی 2E و وێنەی S4B)، ئەمەش ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە ڕەنگە نایەکسانی گۆڕانکارییەکی بەرچاو لە نێوان نەخۆشەکاندا هەبێت. شایەنی باسە کە بە بەراورد لەگەڵ نەخۆشەکانی تر (1.2 بۆ 2 لیتر؛ خشتەی S1)، کۆی بڕی ئاسیتەکانی کۆکراوە لە نەخۆشی 70 (80 مل) کەمتر بووە. کۆنترۆڵکردنی نایەکسانی نێوان نەخۆشەکان لە کاتی شیکاری پێکهاتە سەرەکییەکان (بۆ نموونە، بە بەکارهێنانی شیکاری زیادەڕۆیی بەشەکی) گۆڕانکاری بەردەوام لە نێوان جۆرەکانی خانەدا نیشان دەدات، و جۆرەکانی خانە و/یان ژینگەی بچووک بە ڕوونی بەپێی پرۆفایلی میتابۆلیتەکان کۆدەکرێنەوە (شێوەی 2F). شیکاری تاکە میتابۆلیتەکان جەختی لەسەر ئەم کاریگەرییانە کردەوە و جیاوازییەکی بەرچاوی لە نێوان جۆرەکانی خانە و ژینگەی بچووکدا ئاشکرا کرد. شایەنی باسە کە توندترین جیاوازی کە بینراوە MNA یە کە بەزۆری لە خانەکانی CD45- و لە خانەکانی CD4+ و CD8+ کە دزە دەکەنە ناو وەرەمەکەوە دەوڵەمەندە (شێوەی 3A). بۆ خانەکانی CD4 +، ئەم کاریگەرییە زۆرترین دیارە، و MNA لە خانەکانی CD8 + هەروەها پێدەچێت کاریگەرییەکی بەهێزی لەسەر بێت لەلایەن ژینگەوە. بەڵام ئەمە گرنگ نییە، چونکە تەنها سێ لە شەش نەخۆشەکە دەتوانرێت بۆ نمرەکانی CD8+ی وەرەم هەڵسەنگێندرێت. جگە لە MNA، لە جۆرە جیاوازەکانی خانەکانی ناو ئاسیت و وەرەمەکاندا، میتابۆلیتەکانی تر کە لە TILدا بە شێوەیەکی خراپ تایبەتمەندییان هەیە، بە شێوەیەکی جیاواز دەوڵەمەندن (شێوەکانی S3 و S4). بۆیە ئەم زانیاریانە کۆمەڵەیەکی بەڵێندەر لە میتابۆلیتە بەرگری گۆڕینیەکان بۆ لێکۆڵینەوەی زیاتر ئاشکرا دەکەن.
(A) ناوەڕۆکی ئاسایی MNA لە خانەکانی CD4+، CD8+ و CD45- لە ئاسیت و وەرەم. پڵۆتی بۆکسەکە مامناوەندی (هێڵ)، مەودای نێوان چوارگۆشەکان (هنجی چوارچێوە) و مەودای داتا نیشان دەدات، تا 1.5 هێندەی مەودای نێوان چوارگۆشەکان (چوارچاکی ڕیش). وەک لە کەرەستە و شێوازەکانی نەخۆشدا باسکراوە، بەهای لیمای نەخۆشەکە بەکاربهێنە بۆ دیاریکردنی بەهای P (*P<0.05 و **P<0.01). (B) دیاگرامی نەخشەیی میتابۆلیزمی MNA (60). میتابۆلایتەکان: S-adenosyl-1-methionine؛ SAH، S-adenosine-1-homocysteine؛ NA، نیکۆتینامید؛ MNA، 1-میثیلنیکۆتینامید؛ 2-PY، 1-میثیل- 2-پیریدۆن-5-کاربۆکسامید؛ 4-PY، 1-میثیل-4-پیریدۆن-5-کاربۆکسامید؛ NR، نیکۆتینامید ڕیبۆز؛ NMN، نیکۆتیناماید مۆنۆنۆکلیۆتاید. ئەنزیمەکان (سەوز): NNMT، نیکۆتینامید N-methyltransferase؛ SIRT، سیرتوینەکان؛ NAMPT، نیکۆتینامید فۆسفۆریبۆسیل ترانسفێراز؛ AOX1، ئەلدهید ئۆکسیدایز 1؛ NRK، نیکۆتینامید ڕیبۆساید کیناز؛ NMNAT، نیکۆتینامید مۆنۆ نیوکلیۆتاید ئەدینیلێت ترانسفێراز؛ Pnp1، پورین نیوکلیۆساید فۆسفۆریلاز. (C) t-SNE ی scRNA-seq ی ئاسیت (خۆڵەمێشی) و وەرەم (سوور؛ n = 3 نەخۆش). (D) دەربڕینی NNMT لە دانیشتوانی خانە جیاوازەکاندا کە بە بەکارهێنانی scRNA-seq دەستنیشانکراون. (E) دەربڕینی NNMT و AOX1 لە SK-OV-3، گورچیلەی کۆرپەی مرۆڤ (HEK) 293T، خانەکانی T و خانەکانی T چارەسەرکراوی MNA. دەربڕینی تاودراو بە بەراورد بە SK-OV-3 نیشان دراوە. شێوازی دەربڕین لەگەڵ SEM نیشان دراوە (n = 6 بەخشەری تەندروست). بەهاکانی Ct زیاتر لە 35 بە نەدۆزراو دادەنرێت (UD). (F) دەربڕینی SLC22A1 و SLC22A2 لە SK-OV-3، HEK293T، خانەکانی T و خانەکانی T کە بە 8mM MNA چارەسەرکراون. دەربڕینی تاودراو بە بەراورد بە SK-OV-3 نیشان دراوە. شێوازی دەربڕین لەگەڵ SEM نیشان دراوە (n = 6 بەخشەری تەندروست). بەهاکانی Ct زیاتر لە 35 بە نەدۆزراو دادەنرێت (UD). (G) ناوەڕۆکی MNA خانە لە خانەکانی T بەخشەری تەندروست چالاککراودا دوای 72 کاتژمێر لە کەرەوزکردن لەگەڵ MNA. شێوازی دەربڕین لەگەڵ SEM نیشان دراوە (n = 4 بەخشەری تەندروست).
MNA بە گواستنەوەی گروپی میتیل لە S-adenosyl-1-methionine (SAM) بۆ نیکۆتینامید (NA) لەلایەن نیکۆتینامید N-methyltransferase (NNMT؛ وێنەی 3B) بەرهەم دێت. NNMT لە جۆرەها شێرپەنجەی مرۆڤدا زیاد دەربڕدراوە و پەیوەندی بە بڵاوبوونەوە، داگیرکردن و گوازراوەتەوە هەیە (25-27). بۆ باشتر تێگەیشتن لە سەرچاوەی MNA لە خانەکانی T لە TME، ئێمە scRNA-seqمان بەکارهێنا بۆ تایبەتمەندکردنی دەربڕینی NNMT لە سەرانسەری جۆرەکانی خانەکان لە ئاسیت و وەرەمەکانی سێ نەخۆشی HGSC (خشتەی S5). شیکاری نزیکەی 6,500 خانە دەریخست کە لە ژینگەکانی ئاسیت و وەرەمدا، دەربڕینی NNMT سنووردار بوو بە دانیشتوانی ڕیشاڵە گەورە و خانە وەرەمییە گریمانەکراوەکان (شێوەی 3، C و D). شایەنی باسە کە هیچ دەربڕینێکی ئاشکرای NNMT لە هیچ دانیشتووانێکدا نییە کە PTPRC (CD45 +) دەرببڕێت (شێوەی 3D و وێنەی S5A)، ئەمەش ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە MNA کە لە سپێکتریمی میتابۆلیتەکاندا دۆزراوەتەوە خراوەتە ناو خانەکانی T. دەربڕینی ئەلدەهید ئۆکسیدایز 1 (AOX1) MNA دەگۆڕێت بۆ 1-میثیل-2-پیریدۆن-5-کاربۆکسامید (2-PYR) یان 1-میثیل-4-پیریدۆن-5-کاربۆکسامید (4- PYR); وێنەی 3B) هەروەها سنووردارە بە دانیشتوانی ڕیشاڵە گەورەکان کە COL1A1 دەرئەبڕن (شێوەی S5A)، کە پێکەوە ئاماژە بەوە دەکەن کە خانەکانی T توانای میتابۆلیزمی ئاسایی MNA یان نییە. شێوازی دەربڕینی ئەم جینانەی پەیوەندیدار بە MNA بە بەکارهێنانی کۆمەڵە داتایەکی خانە سەربەخۆی دووەم لە ئاسیت لە نەخۆشانی HGSC پشتڕاستکرایەوە (شێوەی S5B؛ n = 6) (16). سەرەڕای ئەوە، شیکاریی کارلێکی زنجیرەیی پۆلیمیرازی چەندایەتی (qPCR) بۆ خانەکانی T بەخشەری تەندروست کە بە MNA چارەسەر کراون دەریخست کە بە بەراورد لەگەڵ خانەکانی وەرەمی هێلکەدان SK-OV-3 کۆنتڕۆڵکراو، NNMT یان AOX1 نزیکەی دەرنەبڕدراوە (شێوەی 3E). ئەم ئەنجامە چاوەڕواننەکراوانە ئاماژە بەوە دەکەن کە MNA لەوانەیە لە ڕیشاڵە گەورەکان یان وەرەمەکانەوە دەردرێت بۆ خانەکانی T تەنیشت یەکتر لە TME.
هەرچەندە کاندیدەکان خێزانی گواستنەوەی کاتیۆنی ئۆرگانیکی 1 بۆ 3 (OCT1، OCT2 و OCT3) لەخۆدەگرن کە لەلایەن خێزانی هەڵگری تواوەی 22 (SLC22) (SLC22A1، SLC22A2 و SLC22A3) کۆدکراون، بەڵام گواستەرە پۆتانسێلەکانی MNA هێشتا پێناسە نەکراون (28). QPCR ی mRNA لە خانەکانی T بەخشەری تەندروست ئاستی دەربڕینی نزم لە SLC22A1 بەڵام ئاستی دەستنیشاننەکراوی SLC22A2 نیشان دا، کە پشتڕاستی کردەوە کە پێشتر لە وتارەکاندا ڕاپۆرت کراوە (شێوەی 3F) (29). لە بەرامبەردا، هێڵی خانەی وەرەمی هێلکەدان SK-OV-3 ئاستی بەرزی هەردوو گواستەرەوەکە دەربڕی (شێوەی 3F).
بۆ ئەوەی ئەگەری تاقیکردنەوەی ئەگەری خانەکانی T توانای هەڵمژینی MNAی بیانییان هەبێت، خانەکانی T بەخشەری تەندروست بۆ ماوەی 72 کاتژمێر لە ئامادەبوونی چڕیی جیاوازی MNA کشتوکاڵ کران. لە غیابی MNA دەرەکیدا، ناوەڕۆکی خانەیی MNA ناتوانرێت دەستنیشان بکرێت (شێوەی 3G). بەڵام، خانە T چالاککراوەکان کە بە MNA دەرەکی چارەسەر کراون زیادبوونی وابەستە بە ژەمە دەرمانەکەیان لە ناوەڕۆکی MNA لە خانەکاندا نیشان دا، تا 6 mM MNA (شێوەی 3G). ئەم ئەنجامە ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە سەرەڕای ئاستی نزم لە دەربڕینی گواستەرەوە و نەبوونی ئەنزیمە سەرەکییەکە کە بەرپرسە لە میتابۆلیزمی MNAی ناو خانەیی، TIL هێشتا دەتوانێت MNA وەربگرێت.
سپێکتریمی میتابۆلیتەکان لە خانەکانی T نەخۆشەکان و تاقیکردنەوەکانی مژینی MNA لەناو ئامێری پشکنیندا ئەگەری ئەوە زیاد دەکات کە ڕیشاڵە گەورەکانی پەیوەست بە شێرپەنجە (CAF) MNA دەربکەن و خانەکانی وەرەم ڕەنگە فینۆتایپ و کارکردنی TIL ڕێکبخەن. بۆ دیاریکردنی کاریگەری MNA لەسەر خانەکانی T، خانەکانی T بەخشەری تەندروست لە ناو ئامێری پشکنیندا چالاک کران لە ئامادەبوون یان نەبوونی MNA، و بڵاوبوونەوە و بەرهەمهێنانی سایتاکینەکانیان هەڵسەنگێندرا. دوای 7 ڕۆژ لە زیادکردنی MNA لە بەرزترین ژەمدا، ژمارەی دوو هێندەبوونی دانیشتووان بە شێوەیەکی مامناوەند کەم بووەوە، لە کاتێکدا هێز لە هەموو ژەمە دەرمانەکاندا پارێزراو بوو (شێوەی 4A). سەرەڕای ئەوە، چارەسەرکردنی MNA دەرەکی بووە هۆی زیادبوونی ڕێژەی خانەکانی CD4 + و CD8 + T کە فاکتەری نەکرۆزی وەرەم-α دەرئەبڕن (TNFα؛ وێنەی 4B). لە بەرامبەردا، بەرهەمهێنانی ناو خانەیی IFN-γ لە خانەکانی CD4 + T بە شێوەیەکی بەرچاو کەمبووەوە، بەڵام لە خانەکانی CD8 + Tدا نەبوو، و هیچ گۆڕانکارییەکی بەرچاو لە ئینتەرلوکین 2دا نەبوو (IL-2؛ وێنەی 4، C و D). بۆیە، تاقیکردنەوەی بەرگری هەڵمژەری پەیوەست بە ئەنزیم (ELISA)ی سەرەوەی ئەم کولتوورانەی خانە T چارەسەرکراوەکانی MNA زیادبوونی بەرچاوی لە TNFα، کەمبوونەوەی IFN-γ، و هیچ گۆڕانکارییەک لە IL-2دا نیشان نەدا (شێوەی 4، E بۆ G). . کەمبوونەوەی IFN-γ ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە MNA ڕەنگە ڕۆڵێکی هەبێت لە ڕێگریکردن لە چالاکیی دژە وەرەمی خانەکانی T. بۆ ئەوەی کاریگەری MNA لەسەر ژەهراویبوونی خانەیی بە ناوەندگیری خانەی T ھاوشێوە بکرێت، خانەکانی وەرگری دژە جەستەی کایمێریک T (FRα-CAR-T) کە وەرگری فۆلێت α و CAR-T (GFP) دەکەنە ئامانج کە لەلایەن خانەکانی پڕۆتینی فلۆرۆسەنتی سەوز (GFP) -CAR-T) ڕێکدەخرێن لەلایەن خانە تاکگەردیلەکانی خوێنی دەوروبەری بەخشەری تەندروستەوە (PBMC) بەرهەم دەهێنرێن. خانەکانی CAR-T بۆ ماوەی 24 کاتژمێر لە ئامادەبوونی MNA کشتوکاڵ کران، و پاشان هاوبەش کشتوکاڵ کران لەگەڵ خانەکانی وەرەمی هێلکەدانی مرۆڤی SK-OV-3 کە وەرگری فۆلێت α دەرئەبڕن بە ڕێژەی کاریگەر بۆ ئامانج کە 10:1 بوو. چارەسەری MNA بووە هۆی کەمبوونەوەی بەرچاو لە چالاکیی کوشتنی خانەکانی FRα-CAR-T، کە هاوشێوەی خانەکانی FRα-CAR-T بوو کە بە ئەدینۆسین چارەسەر کراون (شێوەی 4H).
(A) کۆی ژمارەی خانە زیندووەکان و دوو هێندەبوونی دانیشتووان (PD) ڕاستەوخۆ لە کشتوکاڵەوە لە ڕۆژی 7. گرافیکی بارەکان مامناوەندی + SEMی شەش بەخشەری تەندروست نیشان دەدات. نوێنەرایەتی داتاکانی لانیکەم n = 3 تاقیکردنەوە سەربەخۆکان دەکات. (B بۆ D) CD3/CD28 و IL-2 بەکارهێنران بۆ چالاککردنی خانەکانی T بە چڕیی MNA ی خۆیان بۆ ماوەی 7 ڕۆژ. پێش شیکاری، خانەکان بە PMA/ionomycin لەگەڵ GolgiStop بۆ ماوەی 4 کاتژمێر هاندرابوون. دەربڕینی TNFα (B) لە خانەکانی T. وێنەی نموونەیی (چەپ) و داتای خشتەیی (ڕاست)ی دەربڕینی TNFα لە خانە زیندووەکاندا. دەربڕینی IFN-γ (C) و IL-2 (D) لە خانەکانی T. دەربڕینی سایتاکینەکان بە ڕێگەی خانەپێوانی لێشاو پێوانە کرا. گرافیکی بارەکان نوێنەرایەتی مامناوەندی (n = 6 بەخشەری تەندروست) + SEM دەکات. شیکاری یەکلایەنەی جیاوازی و پێوەرە دووبارەبووەکان (*P<0.05 و **P<0.01) بەکاربهێنە بۆ دیاریکردنی بەهای P. نوێنەرایەتی داتاکانی لانیکەم n = 3 تاقیکردنەوە سەربەخۆکان دەکات. (E بۆ G) CD3/CD28 و IL-2 بەکارهێنران بۆ چالاککردنی خانەکانی T بە چڕیی MNA ی خۆیان بۆ ماوەی 7 ڕۆژ. ناوەندەکە پێش و دوای 4 کاتژمێر لە هاندانی PMA/ئایۆنۆمایسین کۆکرایەوە. چڕییەکانی TNFα (E)، IFN-γ (F) و IL-2 (G) بە ELISA پێوانە کرا. گرافیکی بارەکان نوێنەرایەتی مامناوەندی (n = 5 بەخشەری تەندروست) + SEM دەکات. بەهای P بە بەکارهێنانی شیکاری یەکلایەنەی جیاوازی و پێوانە دووبارەبووەکان دیاری کراوە (*P<0.05). هێڵی خاڵبەندی سنووری دیاریکردنی دۆزینەوەکە نیشان دەدات. (H) تاقیکردنەوەی لایزەکردنی خانەکان. خانەکانی FRα-CAR-T یان GFP-CAR-T بە ئەدینۆسین (250μM) یان MNA (10 mM) بۆ ماوەی 24 کاتژمێر ڕێکخران، یان چارەسەرنەکراون (Ctrl). ڕێژەی کوشتنی خانەکانی SK-OV-3 پێوانە کرا. بەهای P بە تاقیکردنەوەی Welch t دیاری کراوە (*P<0.5 و **P<0.01).
بۆ ئەوەی تێگەیشتنێکی میکانیکی لە ڕێکخستنی دەربڕینی TNFα وابەستە بە MNA بەدەست بهێنرێت، گۆڕانکارییەکانی TNFα mRNA ی خانەکانی T چارەسەرکراوی MNA هەڵسەنگێندرا (شێوەی 5A). خانەکانی T بەخشەری تەندروست کە بە MNA چارەسەر کراون دوو هێندە زیادبوونی ئاستی نووسینەوەی TNFαیان نیشانداوە، ئەمەش ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە MNA وابەستەی ڕێکخستنی نووسینەوەی TNFα یە. بۆ لێکۆڵینەوە لەم میکانیزمە ڕێکخستنی ئەگەرییە، دوو هۆکاری نووسینەوەی ناسراو کە TNFα ڕێکدەخەن، ئەوانیش فاکتەری ناوکی خانەی T چالاککراو (NFAT) و پڕۆتینی تایبەت 1 (Sp1)، لە وەڵامی بەستنەوەی MNA بە بەرزکەرەوەی TNFαی نزیک هەڵسەنگێنران (30). پرۆمۆتەری TNFα 6 شوێنی بەستنەوەی NFAT دەستنیشانکراو و 2 شوێنی بەستنەوەی Sp1 لەخۆدەگرێت، کە لە یەک شوێندا سەریەک دەکەوێت [-55 جووتە بنەما (bp) لە 5'cap] (30). بەرگری کرۆماتین (ChIP) دەریخست کە کاتێک بە MNA چارەسەر کرا، بەستنەوەی Sp1 بە TNFα پرۆمۆتەر سێ هێندە زیاد دەکات. هەروەها یەکخستنی NFAT زیاد بوو و لە گرنگی نزیک بووەوە (شێوەی 5B). ئەم زانیاریانە ئاماژە بەوە دەکەن کە MNA دەربڕینی TNFα لە ڕێگەی نووسینەوەی Sp1 ڕێکدەخات، و تا ڕادەیەکی کەمتر دەربڕینی NFAT.
(A) بە بەراورد لەگەڵ خانەکانی T کە بەبێ MNA کشتوکاڵ کراون، گۆڕانی قازانجی دەربڕینی TNFα لە خانەکانی T کە بە MNA چارەسەر کراون. شێوازی دەربڕین لەگەڵ SEM نیشان دراوە (n = 5 بەخشەری تەندروست). نوێنەرایەتی داتاکانی لانیکەم n = 3 تاقیکردنەوە سەربەخۆکان دەکات. (B) بەرزکەرەوەی TNFαی خانەکانی T کە بە یان بەبێ 8 mM MNA چارەسەر کراون دوای NFAT و Sp1 لەگەڵ (Ctrl) و هاندانی PMA/ionomycin بۆ ماوەی 4 کاتژمێر تێکەڵ کران. بەرگری گڵۆبۆلین G (IgG) و H3 وەک کۆنتڕۆڵی نەرێنی و پۆزەتیڤ بۆ بەرگری ڕەشبوونەوە بەکارهێنران، بە ڕێککەوت. ژماردنی ChIP دەریخست کە بەستنەوەی Sp1 و NFAT بە بەرزکەرەوەی TNFα لە خانەکانی چارەسەرکراوی MNA چەند هێندە زیادی کردووە بە بەراورد لەگەڵ کۆنتڕۆڵ. نوێنەرایەتی داتاکانی لانیکەم n = 3 تاقیکردنەوە سەربەخۆکان دەکات. بەهای P بە چەندین تاقیکردنەوەی t دیاری کراوە (*** P <0.01). (C) بە بەراورد لەگەڵ ئاسیتی HGSC، خانەکانی T (نا ژەهراویکردنی خانەیی) زیادبوونی دەربڕینی TNFیان لە وەرەمەکەدا نیشان دا. ڕەنگەکان نوێنەرایەتی نەخۆشی جیاواز دەکەن. خانە پیشان دراوەکان بە شێوەیەکی هەڕەمەکی نمونەیان لێ وەرگیراوە بۆ 300 و لەرزین بۆ سنووردارکردنی زیادەکێشان (** Padj = 0.0076). (D) مۆدێلی پێشنیارکراوی MNA بۆ شێرپەنجەی هێلکەدان. MNA لە خانەکانی وەرەم و ڕیشاڵە گەورەکان لە TME بەرهەم دێت و لەلایەن خانەکانی T وەرگیراوە. MNA بەستنەوەی Sp1 بە بەرزکەرەوەی TNFα زیاد دەکات، کە دەبێتە هۆی زیادبوونی نووسینەوەی TNFα و بەرهەمهێنانی سایتاکینەکانی TNFα. هەروەها MNA دەبێتە هۆی کەمبوونەوەی IFN-γ. ڕێگریکردن لە کارکردنی خانەکانی T دەبێتە هۆی کەمبوونەوەی توانای کوشتن و خێراکردنی گەشەی وەرەم.
بەپێی ڕاپۆرتەکان، TNFα کاریگەری دژە وەرەمی و دژە وەرەمی وابەستەی پێشەوە و پشتی هەیە، بەڵام ڕۆڵێکی ناسراوی هەیە لە پێشخستنی گەشەکردن و گوازراوەی شێرپەنجەی هێلکەدان (31-33). بەپێی ڕاپۆرتەکان، چڕیی TNFα لە شانەکانی ئاسیت و وەرەم لە نەخۆشانی تووشبوو بە شێرپەنجەی هێلکەدان زیاترە لە شانە بێهۆشەکان (34-36). لە ڕووی میکانیزمەوە، TNFα دەتوانێت چالاکبوون و کارکردن و بڵاوبوونەوەی خڕۆکە سپییەکانی خوێن ڕێکبخات، و فینۆتایپی خانە شێرپەنجەییەکان بگۆڕێت (37، 38). بەگوێرەی ئەم دۆزینەوانە، شیکاری دەربڕینی جینی جیاواز دەریخست کە TNF بە شێوەیەکی بەرچاو لە خانەکانی T لە شانەکانی وەرەمدا بەرزبووەوە بە بەراورد لەگەڵ ئاسیت (شێوەی 5C). زیادبوونی دەربڕینی TNF تەنها لە دانیشتوانی خانەکانی Tدا دیار بوو کە فینۆتایپی ناسایتۆتۆکسیکیان هەبوو (شێوەی S5A). بە کورتی، ئەم زانیاریانە پشتگیری لەو بۆچوونە دەکەن کە MNA دوو کاریگەری بەرگری سەرکوتکەر و پەرەپێدانی وەرەمی هەیە لە HGSC.
ئاماژەدان بە فلۆرۆسەنت لەسەر بنەمای خانەپێوانی لێشاو بووەتە ڕێگەی سەرەکی بۆ لێکۆڵینەوە لە میتابۆلیزمی TIL. ئەم توێژینەوەیانە دەریانخستووە کە بە بەراورد لەگەڵ لیمفۆسایتی خوێنی دەوروبەر یان خانەکانی T لە ئەندامە لیمفاوییە لاوەکییەکان، TILی مشک و مرۆڤ مەیلی زیاتریان هەیە بۆ وەرگرتنی گلوکۆز (4، 39) و لەدەستدانی وردە وردەی کارکردنی مایتۆکۆندریالەکان (19، 40). هەرچەندە ئێمە ئەنجامە هاوشێوەکانمان لەم لێکۆڵینەوەیەدا بەدیکردووە، بەڵام گەشەسەندنی سەرەکی بریتییە لە بەراوردکردنی میتابۆلیزمی خانەکانی وەرەم و TIL لە هەمان شانە وەرەمییە بڕاوەکان. بەگوێرەی هەندێک لەم ڕاپۆرتانەی پێشوو، خانەکانی وەرەمی (CD45-EpCAM +) لە ئاسیت و وەرەمەکانەوە وەرگرتنی گلوکۆزی زیاتریان هەیە لە چاو خانەکانی CD8 + و CD4 + T، ئەمەش پشتگیری لەوە دەکات کە وەرگرتنی گلوکۆزی بەرزی خانەکانی وەرەم دەتوانرێت لەگەڵ خانەکانی T بەراورد بکرێت. چەمکی کێبڕکێی خانەکانی T. TME. بەڵام چالاکیی مایتۆکۆندریاڵی خانەکانی وەرەم زیاترە لە خانەکانی CD8 + T، بەڵام چالاکیی مایتۆکۆندریال هاوشێوەی خانەکانی CD4 + T یە. ئەم ئەنجامانە ئەو تەوەرە سەرهەڵداوە بەهێز دەکەن کە میتابۆلیزمی ئۆکسجینی گرنگە بۆ خانەکانی وەرەم (41، 42). هەروەها پێشنیاری ئەوە دەکەن کە خانەکانی CD8 + T لەوانەیە زیاتر ئامادەبن بۆ تێکچوونی کارکردنی ئۆکسجینی لە چاو خانەکانی CD4 + T، یان خانەکانی CD4 + T لەوانەیە سەرچاوەی کاربۆنی جگە لە گلوکۆز بەکاربهێنن بۆ پاراستنی چالاکیی مایتۆکۆندریالەکان (43، 44). پێویستە ئاماژە بەوە بکرێت کە ئێمە هیچ جیاوازییەکمان لە وەرگرتنی گلوکۆز یان چالاکیی مایتۆکۆندریال لە نێوان کاریگەرەکانی CD4 + T، بیرەوەری کاریگەری T و خانەکانی یادەوەری ناوەندی T لە ئاسیتدا بەدی نەکرد. بە هەمان شێوە، دۆخی جیاکردنەوەی خانەکانی CD8 + T لە وەرەمەکاندا هیچ پەیوەندییەکی بە گۆڕانکاری لە وەرگرتنی گلوکۆزەوە نییە، ئەمەش جیاوازییەکی بەرچاو لە نێوان خانەکانی T کە لە ناو ئامێری پشکنیندا کشتوکاڵکراون و TILی مرۆڤ لە ناو ئامێری زیندوودا دەردەخات (22). هەروەها ئەم تێبینیانە بە بەکارهێنانی تەرخانکردنی دانیشتوانی خانە ئۆتۆماتیکی بێلایەن پشتڕاستکرانەوە، کە زیاتر ئاشکرای کرد کە خانەکانی CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + کە وەرگرتنی گلوکۆز و چالاکیی مایتۆکۆندریالیان زیاترە لە چاو خانەکانی وەرەم باون بەڵام دانیشتوانی خانە چالاکەکانی میتابۆلیکیان هەیە. ئەم دانیشتووە ڕەنگە نوێنەرایەتی ژێر دانیشتوانی گوماناوی خانە سەرکوتکەرەکانی مایلۆید یان خانە دێندریتییە پلازماسایتۆیدەکان بکات کە لە شیکاری scRNA-seqدا دەستنیشانکراون. هەرچەندە هەردوو ئەمانە لە وەرەمەکانی هێلکەدانی مرۆڤدا ڕاپۆرت کراون [45]، بەڵام هێشتا پێویستیان بە کاری زیاترە بۆ وەسفکردنی ئەم ژێر دانیشتووانەی مایلۆید.
هەرچەندە شێوازەکانی بنەمای خانەپێوانی لێشاو دەتوانن جیاوازییە گشتیەکانی گلوکۆز و میتابۆلیزمی ئۆکسجینی نێوان جۆرەکانی خانەکان ڕوون بکەنەوە، بەڵام میتابۆلیتە وردەکانی بەرهەم هێنراو لەلایەن گلوکۆز یان سەرچاوەی کاربۆنی ترەوە بۆ میتابۆلیزمی مایتۆکۆندریال لە TME هێشتا دیاری نەکراون. تەرخانکردنی بوونی یان نەبوونی میتابۆلیتەکان بۆ ژێرکۆمەڵەیەکی دیاریکراوی TIL پێویستی بە پاککردنەوەی دانیشتوانی خانەکان هەیە لە شانە بڕاوەکان. بۆیە، شێوازی دەوڵەمەندکردنی خانەکانمان لەگەڵ سپێکترۆمێتری بارستەیی دەتوانێت تێڕوانینێک بۆ ئەو میتابۆلیتانە دابین بکات کە بە جیاوازی لە خانەکانی T و دانیشتوانی خانەکانی وەرەمدا دەوڵەمەندن لە نمونەی هاوتاکردنی نەخۆشەکاندا. هەرچەندە ئەم ڕێگایە سوودی هەیە بە بەراورد بە ڕیزکردنی خانە چالاککراوەکانی فلۆرۆسەنس، بەڵام ڕەنگە هەندێک کتێبخانەی میتابۆلیت کاریگەرییان لەسەر بێت بەهۆی سەقامگیری سروشتی و/یان ڕێژەی گۆڕینی خێرا (22). سەرەڕای ئەوەش، شێوازەکەمان توانی دوو میتابۆلیتی بەرگری سەرکوتکەری ناسراو دەستنیشان بکات، ئەدینۆسین و کینۆرینین، چونکە لە نێوان جۆرەکانی نمونەدا زۆر جیاوازن.
شیکاری میتابۆنۆمیکی ئێمە بۆ وەرەمەکان و ژێر جۆرەکانی TIL تێڕوانینێکی زیاتر دەدات بۆ ڕۆڵی میتابۆلیتەکان لە TMEی هێلکەدان. سەرەتا، بە بەکارهێنانی خانەپێوانی لێشاو، دیاریمان کرد کە هیچ جیاوازییەک لە چالاکیی مایتۆکۆندریال لە نێوان وەرەمەکان و خانەکانی CD4 + Tدا نییە. بەڵام، شیکاری LC-MS/MS گۆڕانکاری بەرچاوی لە زۆری میتابۆلیتەکاندا لە نێوان ئەم دانیشتووانەدا ئاشکرا کرد، ئەمەش ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە دەرەنجامەکان سەبارەت بە میتابۆلیزمی TIL و چالاکیی میتابۆلیزمی گشتی پێویستی بە لێکدانەوەی ورد هەیە. دووەم: MNA ئەو میتابۆلیتە کە زۆرترین جیاوازی لە نێوان خانەکانی CD45 و خانەکانی T لە ئاسیتدا هەیە نەک وەرەمەکان. بۆیە، بەشکردن و شوێنی وەرەم ڕەنگە کاریگەری جیاوازیان هەبێت لەسەر میتابۆلیزمی TIL، کە تیشک دەخاتە سەر نایەکسانی ئەگەری لە ژینگەیەکی بچووکی دیاریکراودا. سێیەم: دەربڕینی ئەنزیمی بەرهەمهێنەری MNA NNMT بە شێوەیەکی سەرەکی سنووردارە بە CAF کە تا ڕادەیەکی کەمتر خانەکانی وەرەمن، بەڵام ئاستی MNA ی دەستنیشانکراو لە خانەکانی T وەرگیراو لە وەرەمدا بەدی دەکرێت. زیاد دەربڕینی NNMT لە CAFی هێلکەدان کاریگەرییەکی ناسراوی هەیە بۆ بەرەوپێشبردنی شێرپەنجە، بەشێکیش بەهۆی بەرەوپێشبردنی میتابۆلیزمی CAF، داگیرکردنی وەرەم و گوازراوەتەوە (27). هەرچەندە ئاستی گشتی TIL مامناوەندە، بەڵام دەربڕینی NNMT لە CAF پەیوەندییەکی نزیک بە ژێر جۆری مێزانشیمی ئەتڵەسی جینۆمی شێرپەنجە (TCGA) هەیە، کە پەیوەندی بە پێشبینی خراپەوە هەیە (27، 46، 47). لە کۆتاییدا، دەربڕینی ئەنزیمەکەی AOX1 کە بەرپرسە لە تێکچوونی MNA هەروەها سنووردارە بە دانیشتوانی CAF، ئەمەش ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە خانەکانی T توانای میتابۆلیزکردنی MNA یان نییە. ئەم ئەنجامانە پشتگیری لەو بیرۆکەیە دەکەن کە هەرچەندە کاری زیاتر پێویستە بۆ پشتڕاستکردنەوەی ئەم دۆزینەوە، بەڵام ئاستی بەرزی MNA لە خانەکانی Tدا ڕەنگە ئاماژە بێت بۆ بوونی ژینگەیەکی بچووکی CAFی بەرگری سەرکوتکەر.
بە سەرنجدان بە ئاستی دەربڕینی نزم لە گواستەرەوەکانی MNA و ئاستی دەستنیشاننەکراوی پڕۆتینە سەرەکییەکانی بەشدار لە میتابۆلیزمی MNA، بوونی MNA لە خانەکانی T چاوەڕواننەکراوە. نە NNMT و نە AOX1 نەتوانرا بە شیکاری scRNA-seq و qPCRی ئامانجدار لە دوو کۆهۆرت سەربەخۆ دەستنیشان بکرێن. ئەم ئەنجامانە ئاماژە بەوە دەکەن کە MNA لەلایەن خانەکانی Tەوە دروست نابێت، بەڵکو لە TMEی دەوروبەرەوە هەڵدەمژرێت. تاقیکردنەوەکانی ناو ئامێری پشکنینی دەرەکی دەریدەخەن کە خانەکانی T مەیلیان هەیە MNA دەرەکی کۆبکەنەوە.
توێژینەوەکانی ناو ئامێری پشکنینی دەرەکیمان دەریانخستووە کە MNA دەرەکی دەربڕینی TNFα لە خانەکانی Tدا هاندەدات و بەستنەوەی Sp1 بە بەرزکەرەوەی TNFα بەرز دەکاتەوە. هەرچەندە TNFα هەردوو ئەرکی دژە وەرەمی و دژە وەرەمی هەیە، بەڵام لە شێرپەنجەی هێلکەداندا، TNFα دەتوانێت گەشەی شێرپەنجەی هێلکەدان بەرەوپێش ببات (31-33). بێلایەنکردنی TNFα لە کشتوکاڵی خانەکانی وەرەمی هێلکەدان یان نەهێشتنی سیگناڵی TNFα لە مۆدێلی مشکدا دەتوانێت بەرهەمهێنانی سایتاکینی هەوکردن بە ناوەندگیری TNFα باشتر بکات و گەشەی وەرەمەکە ڕێگری بکات (32، 35). بۆیە لەم حاڵەتەدا، MNAی وەرگیراو لە TME دەتوانێت وەک میتابۆلیتێکی لایەنگری هەوکردن لە ڕێگەی میکانیزمێکی وابەستە بە TNFα لە ڕێگەی لوپی ئۆتۆکرینەوە کاربکات، بەمەش ڕوودان و بڵاوبوونەوەی شێرپەنجەی هێلکەدان بەرەوپێش دەبات (31). لەسەر بنەمای ئەم ئەگەرە، گەمارۆدانی TNFα وەک هۆکارێکی چارەسەری پۆتانسێل بۆ شێرپەنجەی هێلکەدان لێکۆڵینەوەی لەسەر دەکرێت (37، 48، 49). سەرەڕای ئەوە، MNA ژەهراویبوونی خانەکانی خانەکانی CAR-T بۆ خانەکانی وەرەمی هێلکەدان تێکدەدات، ئەمەش بەڵگەی زیاتر بۆ سەرکوتکردنی بەرگری بە ناوەندگیری MNA دابین دەکات. بە کۆ، ئەم ئەنجامانە مۆدێلێک پێشنیار دەکەن کە تێیدا وەرەمەکان و خانەکانی CAF MNA دەردەکەن بۆ ناو TME دەرەوەی خانەیی. لە ڕێگەی (i) هاندانی گەشەی شێرپەنجەی هێلکەدان بەهۆی TNF و (ii) ڕێگریکردن لە چالاکیی ژەهراویکردنی خانەیی خانەی T بەهۆی MNA، ئەمە ڕەنگە کاریگەری دووانەی وەرەمی هەبێت (شێوەی 5D).
لە کۆتاییدا، بە بەکارهێنانی تێکەڵەیەک لە دەوڵەمەندکردنی خێرای خانەکان، ڕێکخستنی تاکە خانەیی و پرۆفایلی گۆڕانکاری خۆراک، ئەم توێژینەوەیە جیاوازییە گەورەی بەرگری میتابۆلۆمیکی نێوان خانەکانی وەرەم و ئاسیت لە نەخۆشانی HGSC ئاشکرا کرد. ئەم شیکارییە گشتگیرە دەریخست کە جیاوازی لە وەرگرتنی گلوکۆز و چالاکیی مایتۆکۆندریال لە نێوان خانەکانی Tدا هەیە، و MNA وەک میتابۆلیتێکی ڕێکخەری بەرگری سەربەخۆی ناخانە دەستنیشان کرد. ئەم زانیاریانە کاریگەرییان لەسەر چۆنیەتی کاریگەری TME لەسەر میتابۆلیزمی خانەکانی T لە شێرپەنجەکانی مرۆڤدا هەیە. هەرچەندە کێبڕکێی ڕاستەوخۆ بۆ ماددە خۆراکیەکان لە نێوان خانەکانی T و خانە شێرپەنجەییەکان ڕاپۆرت کراوە، بەڵام میتابۆلیتەکان دەتوانن وەک ڕێکخەری ناڕاستەوخۆ کاربکەن بۆ پێشخستنی پێشکەوتنی وەرەم و لەوانەیە وەڵامەکانی بەرگری ناوخۆیی سەرکوت بکەن. وەسفکردنی زیاتری ڕۆڵی کارایی ئەم میتابۆلیتە ڕێکخەرانە ڕەنگە ستراتیژی بەدیل بۆ بەرزکردنەوەی وەڵامی بەرگری دژە وەرەمی بکاتەوە.
نمونەی نەخۆش و زانیارییە کلینیکیەکان لە ڕێگەی کۆگای شانەکانی وەرەمی شێرپەنجەی BC وەرگیرا کە لەلایەن تۆڕی کۆگای شانەکانی کەنەدا بڕوانامەی پێدراوە. بەپێی ئەو پرۆتۆکۆڵەی کە لەلایەن لیژنەی ئەخلاقی توێژینەوەی شێرپەنجەی بی سی و زانکۆی بریتیش کۆڵۆمبیا (H07-00463) پەسەندکراوە، هەموو نمونەکانی نەخۆشەکان و زانیارییە کلینیکیەکان ڕەزامەندی نووسراوی ئاگادارکراویان بەدەستهێناوە یان بە فەرمی دەستبەرداری ڕەزامەندی خۆیان بوون. نمونەکان لە بایۆبانکی بڕوانامەدار (BRC-00290) هەڵدەگیرێن. تایبەتمەندییە وردەکانی نەخۆش لە خشتەکانی S1 و S5 دا نیشان دراون. بۆ پاراستنی بەستوو، ئامێری چەقۆ بەکاردەهێنرێت بۆ شیکردنەوەی میکانیکی نمونەی وەرەمی نەخۆشەکە و پاشان پاڵنانی بە فلتەرێکی 100 مایکرۆن بۆ بەدەستهێنانی هەڵپەسێردراوی تاکە خانە. ئاسیتی نەخۆشەکە بە خێرایی 1500 خولەک لە خولەکێکدا بۆ ماوەی 10 خولەک لە پلەی گەرمی 4 پلەی سەدیدا سەنتەرفۆج کرا بۆ ئەوەی خانەکان چەقۆ لێبدرێت و شلەی سەرەوە لاببرێت. خانەکانی وەرگیراو لە وەرەم و ئاسیت لە 50% سیرۆمی AB مرۆڤی ناچالاککراوی گەرمی (Sigma-Aldrich)، 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) و 10% دیمیثیل سەلفۆکساید بە بەستوو پارێزراون. ئەم هەڵپەسێردراوانەی تاکە خانە پارێزراوانە تواوەتەوە و بۆ میتابۆلۆمیک و دیاریکردنی میتابۆلیت بەکارهێنران کە لە خوارەوە باسکراوە.
ناوەندە تەواوەکە پێکهاتووە لە 0.22 میکرۆمتر فلتەرکراوی 50:50 تەواوکەری RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 میلی مۆلی ل-گلوتامین (Thermo Fisher Scientific) تەواوکراوە بە 10% سیرۆمی AB مرۆیی ناچالاککراوی گەرمی (Sigma-Aldrich)، 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific)، 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific)، 1 x گیراوەی پەنسلین سترێپتۆمایسین (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) و 50 μMB-mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) بە 20 میلی مۆلی هێپێس (Thermo Fisher Scientific) و 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) تەواو دەکرێت. بافەری ڕەنگکردنی سایتۆمێتری لێشاو پێکهاتبوو لە 0.22 میکرۆمتر فلتەرکراوی فۆسفات بافەرکراوی خوێ (PBS؛ ئینڤیترۆجین) کە بە 3% سیرۆمی مرۆڤی AB ناچالاککراوی گەرمی (سیگما) تەواوکرابوو. بافەری دەوڵەمەندکردنی خانەکان لە PBS فلتەرکراوی 0.22μm پێکهاتووە و بە سیرۆمی AB مرۆیی 0.5% ناچالاککراوی گەرمی (Sigma-Aldrich) تەواوکراوە.
لە ناوەندێکی تەواودا لە پلەی گەرمی 37 پلەی سەدی، خانەکان بە 10 نانۆمۆلی MT DR و 100 میکرۆمۆلی 2-NBDG بۆ ماوەی 30 خولەک ڕەنگ کران. دواتر، خانەکان بە بۆیەی توانای ژیان eF506 لە پلەی گەرمی 4 پلەی سەدی بۆ ماوەی 15 خولەک ڕەنگ کران. خانەکان لە FC Block (eBioscience) و Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) هەڵبوەشێنەرەوە، لەناو بافەری ڕەنگکردنی سایتۆمێتری لێشاودا شل بکەرەوە (بەپێی ڕێنماییەکانی بەرهەمهێنەر)، و بۆ ماوەی 10 خولەک لە پلەی گەرمی ژووردا کەرەوز بکە. خانەکان بە کۆمەڵێک دژەتەن ڕەنگ بکە (خشتەی S2) لە بافەری ڕەنگکردنی خانەپێوانی لێشاودا لە پلەی گەرمی 4 پلەی سەدی بۆ ماوەی 20 خولەک. خانەکان لە بافەری ڕەنگکردنی خانەپێوانی لێشاودا هەڵواسەوە (Cytek Aurora؛ پێکهاتەی 3L-16V-14B-8R) پێش شیکاری. بۆ شیکردنەوەی داتاکانی ژمارەی خانەکان SpectroFlo و FlowJo V10 بەکاربهێنە، و GraphPad Prism 8 بەکاربهێنە بۆ دروستکردنی داتاکان. مامناوەندی چڕی فلۆرۆسەنس (MFI)ی 2-NBDG و MT DR لۆگ-ئاسایی کرا، و پاشان تاقیکردنەوەی t جووتە بۆ شیکاری ئاماری بەکارهات بۆ حسابکردن بۆ نەخۆشە هاوتاکان. هەموو ئەو دانیشتووانەی کە کەمتر لە ٤٠ ڕووداویان هەیە لە شیکارییەکەدا لاببەن؛ پێش ئەنجامدانی شیکاری ئاماری و بینینی داتا بەهایەکی MFI 1 بۆ هەر بەهایەکی نەرێنی داخڵ بکە.
بۆ ئەوەی ستراتیژی دەروازەسازی دەستی پانێڵی پرۆسەی سەرەوە تەواو بکەین، ئێمە تێبینی تەواومان بەکارهێنا لەلایەن درەختی سنووردارکردنی شێوە (FAUST) (21) بۆ تەرخانکردنی خانەکان بە شێوەیەکی ئۆتۆماتیکی بۆ دانیشتووان دوای نەهێشتنی خانە مردووەکان لە FlowJo. ئێمە بە دەستی دەرئەنجامەکە بەڕێوەدەبەین بۆ تێکەڵکردنی ئەو دانیشتووانانەی کە پێدەچێت بە هەڵە تەرخانکرابن (تێکەڵکردنی PD1+ لەگەڵ خانەکانی PD1-وەرەمی) و دانیشتوانی ڕاگیراو. هەر نمونەیەک بە تێکڕا زیاتر لە 2% خانەکانی تێدایە، بۆ کۆی گشتی 11 دانیشتووان.
سەنتەرفۆجی چڕی فیکۆڵ گرادێنت بەکارهات بۆ جیاکردنەوەی PBMC لە بەرهەمەکانی جیاکردنەوەی خانە سپییەکان (STEMCELL Technologies). خانەکانی CD8 + T لە PBMC جیاکرانەوە بە بەکارهێنانی CD8 MicroBeads (Miltenyi) و لە ناوەندێکی تەواودا فراوانکران بە بەکارهێنانی TransAct (Miltenyi) بۆ ماوەی 2 هەفتە بەپێی ڕێنماییەکانی بەرهەمهێنەر. خانەکان ڕێگەیان پێدرا بۆ ماوەی 5 ڕۆژ لە ناوەندێکی تەواودا بوەستن کە IL-7 (10 نانوگرەم/میلی لیتر؛ PeproTech)ی تێدابوو، و پاشان بە TransAct هاندرانەوە. لە ڕۆژی حەوتەمدا بەپێی ڕێنماییەکانی بەرهەمهێنەر، مایکرۆبیدەکانی مرۆڤی CD45 (Miltenyi) بەکارهێنران بۆ دەوڵەمەندکردنی خانەکان لە سێ خولی یەک لە دوای یەکدا. خانەکان بۆ شیکاری خانەپێوانی لێشاو دابەش کران (وەک لە سەرەوە باسکراوە)، و یەک ملیۆن خانە سێ جار بەش کران بۆ شیکاری LC-MS/MS. نمونەکان بە LC-MS/MS پرۆسێس کران وەک لە خوارەوە باسکراوە. ئێمە بەهای میتابۆلیتە ونبووەکانمان بە ژمارەی ئایۆنێکی 1000 خەمڵاند. هەر نمونەیەک بە ژمارەی کۆی ئایۆنەکان (TIC) ئاسایی دەکرێتەوە، بە شێوەیەکی لۆگاریتمی دەگۆڕدرێت و بە شێوەیەکی ئۆتۆماتیکی لە MetaboAnalystR ئاسایی دەکرێتەوە پێش شیکاری.
هەڵپەسێردراوی تاکە خانەی هەر نەخۆشێک تواوەتەوە و لە ڕێگەی فلتەرێکی 40 میکرۆمترەوە فلتەر کرا بۆ ناو ناوەندێکی تەواو (وەک لە سەرەوە باسکراوە). بەپێی پرۆتۆکۆڵی بەرهەمهێنەر، سێ خولی یەک لە دوای یەک لە هەڵبژاردنی ئەرێنی بە جیاکردنەوەی کۆپەڵە موگناتیسیەکان بە بەکارهێنانی مایکرۆبیدز (Miltenyi) بەکارهێنرا بۆ دەوڵەمەندکردنی نمونەکان بۆ خانەکانی CD8+، CD4+ و CD45- (لە سەر سەهۆڵ). بە کورتی خانەکان لەناو بافەری دەوڵەمەندکردنی خانەکاندا هەڵدەواسرێنەوە (وەک لە سەرەوە باسکراوە) و دەژمێردرێن. خانەکان لەگەڵ کۆپەڵەی CD8ی مرۆڤ، کۆپەڵەی CD4ی مرۆڤ یان کۆپەڵەی CD45ی مرۆڤ (Miltenyi) لە پلەی گەرمی 4 پلەی سەدی بۆ ماوەی 15 خولەک کەرەوز کران، و پاشان بە بافەری دەوڵەمەندکردنی خانەکان شۆردران. نمونەکە بە ستوونی LS (Miltenyi)دا تێدەپەڕێت، و بەشە ئەرێنی و نەرێنییەکان کۆدەکرێنەوە. بۆ ئەوەی ماوەی کارکردنەکە کەم بکرێتەوە و هەنگاوی چاکبوونەوەی خانەکان زۆرترین بێت، دواتر بەشە CD8 بۆ خولی دووەمی دەوڵەمەندکردنی CD4+ بەکاردەهێنرێت، و بەشە CD4 بۆ دەوڵەمەندکردنی CD45ی دواتر بەکاردەهێنرێت. بە درێژایی پرۆسەی جیاکردنەوەکە گیراوەکە لەسەر سەهۆڵ بهێڵەرەوە.
بۆ ئامادەکردنی نمونەکان بۆ شیکاری میتابۆلیتەکان، خانەکان جارێک بە گیراوەی خوێی سارد و سەهۆڵاوی شۆردران، و 1 مل میتانۆلی 80% بۆ هەر نمونەیەک زیادکرا، پاشان گێژەڵوکە و بەپەلە لە نایترۆجینی شلدا بەستران. نمونەکان سێ خولی بەستن-توانەوەیان خستە ژێر کاریگەرییەوە و بە خێرایی 14,000 خولەک لە خولەکێکدا بۆ ماوەی 15 خولەک لە پلەی گەرمی 4 پلەی سەدیدا سەنتەرفۆج کران. ئەو شلەی سەرەوەی کە میتابۆلیتەکانی تێدایە بەهەڵم دەکرێت تاوەکو وشک دەبێتەوە. میتابۆلیتەکان لە 50 میکرۆلیتر ترشی فۆرمیک 0.03% تواوەتەوە، گێژەڵوکە کران بۆ تێکەڵکردن، و پاشان سەنتەرفۆج کران بۆ لابردنی پاشماوە.
میتابۆلیتەکان دەربهێنە وەک لە سەرەوە باسکراوە. گواستنەوەی شلەی سەرەوە بۆ شووشەیەکی کرۆماتۆگرافی شلەی کارایی بەرز بۆ لێکۆڵینەوە لە میتابۆلۆمیک. پرۆتۆکۆڵی چارەسەری هەڕەمەکی بەکاربهێنە بۆ چارەسەرکردنی هەر نمونەیەک بە ژمارەیەکی هاوشێوەی خانەکان بۆ ڕێگریکردن لە کاریگەرییەکانی وەجبە. ئێمە هەڵسەنگاندنێکی چۆنایەتیمان بۆ میتابۆلیتە جیهانییەکان ئەنجامدا کە پێشتر لەسەر سپێکترۆمێتری بارستەیی سێ چوار جەمسەری AB SCIEX QTRAP 5500 بڵاوکرابوونەوە (50). شیکاری کرۆماتۆگرافی و یەکخستنی ناوچەی لوتکە بە بەکارهێنانی نەرمەکاڵای MultiQuant وەشانی 2.1 (Applied Biosystems SCIEX) ئەنجامدرا.
ژمارەی ئایۆنەکانی 1000 بەکارهێنرا بۆ خەمڵاندنی بەهای میتابۆلیتە ونبووەکان، و TIC ی هەر نمونەیەک بەکارهێنرا بۆ حیسابی ڕووبەری لوتکەی ئاساییکراوی هەر میتابۆلیتە دۆزراوێک بۆ ڕاستکردنەوە بۆ گۆڕانکارییەکان کە لەلایەن شیکاری ئامێرییەوە لە پرۆسێسی نمونەوە هاتنە ئاراوە. دوای ئەوەی TIC ئاسایی بووەوە، MetaboAnalystR(51) (پارامێتەرێکی پێشوەختە) بۆ گۆڕینی لۆگاریتمی و پێوانەکردنی هێڵی نۆرم ئۆتۆماتیکی بەکاردەهێنرێت. ئێمە PCAمان بەکارهێنا لەگەڵ پاکێجی R ڤیگن بۆ ئەنجامدانی شیکاری گەڕان بەدوای جیاوازییەکانی میتابۆلۆم لە نێوان جۆرەکانی نمونەدا، و شیکاری زیادەڕۆیی بەشەکیمان بەکارهێنا بۆ شیکردنەوەی نەخۆشەکان. شێوازی وارد بەکاربهێنە بۆ دروستکردنی دێندرۆگرامی نەخشەی گەرمی بۆ کۆکردنەوەی مەودای ئیوکلیدی نێوان نمونەکان. ئێمە لیما (52)مان بەکارهێنا لەسەر زۆری میتابۆلیتە ستانداردەکان بۆ دیاریکردنی میتابۆلیتە زۆرە جیاوازەکان لە سەرانسەری جۆری خانە و ژینگەی بچووکدا. بۆ ئەوەی ڕوونکردنەوەکە ئاسانتر بکەین، ئێمە پارامێتری مامناوەندی گروپ بەکاردەهێنین بۆ دیاریکردنی مۆدێلەکە، و جۆرەکانی خانەکان لە ژینگەی بچووکدا وەک هەر گروپێک لەبەرچاو دەگرین (n = 6 گروپ)؛ بۆ تاقیکردنەوەی گرنگی، سێ پێوانەکردنی دووبارەمان بۆ هەر میتابۆلیتێک ئەنجامدا بۆ ئەوەی دووبارەبوونەوەی ساختە نەبێت، نەخۆشەکە وەک بەربەستێک لە دیزاینی لیمادا جێگیرکرا. بۆ ئەوەی جیاوازی میتابۆلیتەکان لە نێوان نەخۆشە جیاوازەکاندا بپشکنین، ئێمە مۆدێلی لیمامان ڕێکخست کە نەخۆشەکان لەخۆگرتبوو بە شێوەیەکی جێگیر. ئێمە گرنگی جیاوازی پێشوەختە دیاریکراو لە نێوان جۆری خانە و ژینگەی بچووکی Padj <0.05 (ڕاستکردنەوەی بێنیامینی-هۆچبێرگ) ڕاپۆرت دەکەین.
پاش دەوڵەمەندکردنی هێز بە بەکارهێنانی کیتی لابردنی خانەی مردووی میلتێنی (>80% توانای ژیان)، ڕێکخستنی ترانسکریپتۆمی تاکە خانەیی لەسەر کۆی گشتی ئاسیتی بەستووی زیندوو و نمونەکانی وەرەم بە بەکارهێنانی پرۆتۆکۆڵی دەربڕینی 10x 5'جین ئەنجامدرا. پێنج حاڵەت کە وەرەم و ئاسیتیان هاوتا بوو شیکرانەوە، هەرچەندە توانای ژیانی کەم لە یەک نمونەی وەرەمەوە ڕێگری لە وەرگرتنی کرد. بۆ ئەوەی چەندین هەڵبژاردنی نەخۆشەکان بەدەست بهێنین، ئێمە نمونەکانی هەر نەخۆشێکمان لە هێڵەکانی کۆنترۆڵکەری کرۆمی 10x کۆکردەوە، و شوێنی ئاسیت و وەرەمەکانمان بە جیا شیکردەوە. دوای ڕێکخستن [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp کۆتایی جووت (PE)، جینۆمی کیوبیک؛ بە تێکڕا 73,488 و 41,378 خوێندنەوە بۆ هەر خانەیەک بۆ وەرەم و ئاسیت بە ڕێککەوت]]، ئێمە CellSNP و Vireo (53)مان بەکارهێنا (بە پشتبەستن بە CellSNP وەک SNP باوی مرۆڤ (VCF) کە لەلایەن GRCh38 دابینکراوە ناسنامەی بەخشەرێکی بۆ دیاری کراوە. ئێمە SNPRelate بەکاردەهێنین بۆ دەرخستنی نزیکترین ناسنامە (IBS)ی دۆخی جۆری جینۆتیپی نەخۆشەکە (IBS)، بەدەرکردنی خانە دیارینەکراوەکان و خانەکان کە وەک دوولایەنە دەستنیشانکراون و هاوتاکردنی بەخشەرەکان لە نێوان ئاسیت و نمونەی وەرەمدا (54) لەسەر بنەمای ئەم ئەرکە، ئێمە سێ حاڵەتمان هێشتەوە کە نوێنەرایەتی خانەیەکی زۆریان هەبوو لە وەرەمەکەدا و ئاسیتس بۆ شیکاری خوارەوە دوای ئەنجامدانی هەنگاوێکی پاڵاوتنی بارستەیی لە پاکەتکردنی بایۆکۆندێکتەر (55) و سکران (56)، ئەمە 697 خانەی بەدەستهێنا (2792 و 4183 خانە لە وەرەم و ئاسیت، بە ڕێککەوت) بۆ شیکاری ئێمە igraph's (57) کۆکردنەوەی تۆڕی دراوسێی هاوبەش (SNN) بەکاردەهێنین لەسەر بنەمای مەودای جاکارد بۆ خانەکانی پۆل بە دەربڕین پۆلەکان بە دەست تێبینی کران بۆ جۆرەکانی خانە گوماناویەکان لەسەر بنەمای دەربڕینی جینی نیشاندەر بە دەربڕینی CD8A و GZMA پێناسە کراوە، بەبێ ئەو ژێرپۆلانەی کە دەربڕینی پڕۆتینی ڕیبۆسۆمی کەمیان هەیە، ئێمە دەستمان بە داتا بڵاوکراوەکانی Izar et al (16) گەیشتوە، لەوانەش جێگیرکردنی t-SNE یان، دەتوانێت سەریەککەوتنی دەربڕین لە نێوان نیشاندەرەکانی خانەی بەرگری و دەربڕینی NNMT کۆنتڕۆڵ بکات.
PBMC لە بەرهەمەکانی جیاکردنەوەی خانە سپییەکان (STEMCELL Technologies) بە سەنتەرفۆجکردنی چڕی گرادێنت فیکۆڵ جیاکرانەوە. خانەکانی CD3 + لە PBMC جیاکرانەوە بە بەکارهێنانی CD3 beads (Miltenyi). لە بوونی یان نەبوونی MNA، خانەکانی CD3+ بە CD3 بەستراو بە پلاکی (5μg/ml)، CD28ی تواوە (3μg/ml) و IL-2 (300 U/ml؛ Proleukin) چالاک کران. لە کۆتا ڕۆژی فراوانکردندا، توانای ژیان (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) و بڵاوبوونەوە (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) بە ڕێگەی خانەپێوانی لێشاو هەڵسەنگێندرا. هەڵسەنگاندنی کارکردنی کاریگەر بە هاندانی خانەکان بە PMA (20 نانوگرەم/میلی لیتر) و ئایۆنۆمایسین (1 میکرۆگرام/میلی لیتر) لەگەڵ گۆڵجیستۆپ بۆ ماوەی 4 کاتژمێر، و چاودێریکردنی CD8-PerCP (RPA-T8، BioLegend)، CD4-AF700 (RPA-T4) ، BioLegend) و TNFα-فلۆرۆسێین ئایزۆتۆسیانات (FITC) (MAb11، BD). خانەکانی qPCR و ChIP بە PMA (20 نانوگرەم/میلی لیتر) و ئایۆنۆمایسین (1 میکرۆگرام/میلی لیتر) بۆ ماوەی 4 کاتژمێر هان بدە. شلەی سەرەوەی ELISA پێش و دوای هاندانی بە PMA (20 نانوگرەم/میلی لیتر) و ئایۆنۆمایسین (1 میکرۆگرام/میلی لیتر) بۆ ماوەی 4 کاتژمێر کۆکرایەوە.
بۆ جیاکردنەوەی RNA بە بەکارهێنانی RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) پرۆتۆکۆڵی بەرهەمهێنەر پەیڕەو بکە. بۆ یەکسانکردنی نمونەکە QIAshredder (QIAGEN) بەکاربهێنە. بەکارهێنانی کیتی توانای بەرزی RNA بۆ cDNA (Thermo Fisher Scientific) بۆ دروستکردنی DNAی تەواوکەر (cDNA). بەکارهێنانی TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) بۆ ژماردن و دیاریکردنی دەربڕینی جینەکان (بەپێی پرۆتۆکۆڵی بەرهەمهێنەر) لەگەڵ ئەم پشکنەرانەی خوارەوە: Hs00196287_m1 (NNMT)، Hs00154079_m1 (AOX1)، Hs00427552_m1 (SLC22A1)، Hs02786624_g1 [گلیسیراڵدەهید-3-فۆسفات ئۆف هایدرۆجین (GAPDH)] و Hs01010726_m1 (SLC22A2). نمونەکان لەسەر سیستەمی PCR لە کاتی ڕاستەقینەی StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) لە پلاکی کارلێکی خێرای بینایی 96 بیری MicroAmp (Applied Biosystems) لەگەڵ فیلمی بینایی MicroAmp بەڕێوەچوو. هەر بەهایەکی Ct کە لە 35 زیاتر بێت بە سەرووی ئاستی دیاریکردن دادەنرێت و وەک نەدۆزراو نیشانە دەکرێت.
ChIP وەک پێشتر باسکراوە ئەنجام بدە (58). بە کورتی خانەکان بە فۆرماڵدەهید چارەسەر کران (چڕیی کۆتایی 1.42%) و لە پلەی گەرمی ژووردا بۆ ماوەی 10 خولەک کەرەوز کران. بەکارهێنانی بافەری ئاوسانی تەواوکراو (25 میلی مۆلی هێپێس، 1.5 میلی مۆلی MgCl2، 10 میلی مۆلی KCl و 0.1% NP-40) لەسەر سەهۆڵ بۆ ماوەی 10 خولەک، پاشان لە بافەری بەرگریدا هەڵیبواسەوە وەک باسکراوە (58). پاشان نمونەکە بەم خولانەی خوارەوە سۆنیکی کرا: 10 خول (20 پەلسی 1 چرکە) و کاتێکی ئیستاتیک 40 چرکە. دژەتەنی بەرگری گڵۆبولین G (تەکنەلۆژیای ئاماژەدانی خانەیی؛ 1μl)، هیستۆن H3 (تەکنەلۆژیای ئاماژەدانی خانەیی؛ 3μl)، NFAT (Invitrogen؛ 3μl) و SP1 (تەکنەلۆژیای ئاماژەدانی خانەیی؛ 3μl) لەگەڵ نمونەکەدا لە پلەی گەرمی 4°CC بۆ ماوەی شەوێک کەرەوز بکە. کەرەوزکردنی پرۆتینی A beads (Thermo Fisher Scientific) لەگەڵ نمونەکە لە پلەی گەرمی 4°C لەگەڵ لەرزینێکی نەرم بۆ ماوەی 1 کاتژمێر، پاشان بەکارهێنانی beads chelex (Bio-Rad) بۆ دەوڵەمەندکردنی DNA، و بەکارهێنانی پرۆتیناز K (Thermo Fisher) بۆ هەرسکردنی پڕۆتین. پرۆمۆتەری TNFα بە PCR دۆزراوەتەوە: پێشەوە، GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT؛ بە پێچەوانەوە، GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (بەرهەمی 207-bp). وێنەکان لەلایەن تاقیگەی وێنە (Bio-Rad) بەرهەم هێنراون و بە بەکارهێنانی نەرمەکاڵای ImageJ ژمارەیی کراون.
شلەی سەرەوەی کشتوکاڵی خانەکان وەک لە سەرەوە باسکراوە کۆکرایەوە. دیاریکردنەکە بەپێی ڕێکارەکانی بەرهەمهێنەر لە کیتی TNFα ELISA مرۆڤ (Invitrogen)، کیتی IL-2 ELISA مرۆڤ (Invitrogen) و کیتی IFN-γ ELISA مرۆڤ (Abcam) ئەنجامدرا. بەپێی پرۆتۆکۆڵی بەرهەمهێنەر، شلەمەنی سەرەوە بە ڕێژەی 1:100 شلکرایەوە بۆ دیاریکردنی TNFα و IL-2، و 1:3 بۆ دیاریکردنی IFN-γ. بۆ پێوانەکردنی توانای مژینی لە 450 نانۆمەتردا، خوێنەری فرە ناوی EnVision 2104 (PerkinElmer) بەکاربهێنە.
PBMC لە بەرهەمەکانی جیاکردنەوەی خانە سپییەکان (STEMCELL Technologies) بە سەنتەرفۆجکردنی چڕی گرادێنت فیکۆڵ جیاکرانەوە. خانەکانی CD3 + لە PBMC جیاکرانەوە بە بەکارهێنانی CD3 beads (Miltenyi). لە بوونی یان نەبوونی MNA، خانەکانی CD3+ بە CD3 بەستراو بە پلاکی (5μg/ml)، CD28ی تواوە (3μg/ml) و IL-2 (300 U/ml؛ Proleukin) بۆ ماوەی 3 ڕۆژ چالاک کران. دوای 3 ڕۆژ، خانەکان کۆکرانەوە و بە 0.9% خوێ شۆردران، و گوللەکە بە خێرایی بەسترا. ژماردنی خانەکان بە ڕێگەی خانەپێوانی لێشاو (Cytek Aurora؛ پێکهاتەی 3L-16V-14B-8R) بە بەکارهێنانی 123count eBeads ئەنجامدرا.
میتابۆلیتەکان دەربهێنە وەک لە سەرەوە باسکراوە. دەرهاویشتەی وشککراوە بە چڕیی 4000 هاوتای خانە/میکرۆلیتر پێکهاتەوە. شیکاری نمونەکە بکە بە کرۆماتۆگرافی قۆناغی پێچەوانە (1290 Infinity II، Agilent Technologies، Santa Clara, CA) و ستوونی CORTECS T3 (2.1×150 ملم، قەبارەی تەنۆلکەکان 1.6-μm، قەبارەی کونیلەکان 120-Å؛ #186008500، Waters). سپێکترۆمێتری بارستەی جەمسەری (6470، Agilent)، کە تێیدا ئایۆنیزەکردنی ئەلکترۆسپرای لە دۆخی ئەرێنیدا کاردەکات. قۆناغی جووڵاو A 0.1% ترشی فۆرمیک (لە H2O)، قۆناغی جووڵاو B 90% ئەسیتۆنیتڕیلە، 0.1% ترشی فۆرمیک. گرادێنتەکەی LC 0 بۆ 2 خولەکە بۆ 100% A، 2 بۆ 7.1 خولەک بۆ 99% B، و 7.1 بۆ 8 خولەک بۆ 99% B. پاشان ستوونەکە لەگەڵ قۆناغی جووڵاو A بە ڕێژەی لێشاوی 0.6 مل/دەقە بۆ ماوەی 3 خولەک هاوسەنگ بکەرەوە. . ڕێژەی لێشاوی 0.4ml/min یە، و ژووری ستوونەکە گەرم دەکرێت بۆ 50°C. ستانداردی کیمیایی پاکی MNA بەکاربهێنە (M320995، کۆمپانیای کیمیایی توێژینەوەی تۆرۆنتۆ، باکووری یۆرک، ئۆنتاریۆ، کەنەدا) بۆ دامەزراندنی کاتی ڕاگرتن (RT) و گۆڕانکاری (RT = 0.882 خولەک، گۆڕانکاری 1 = 137→94.1، گۆڕانکاری 2 = 137→92، گۆڕینی 3 = 137→78). کاتێک هەر سێ گواستنەوەکە لە کاتی ڕاگرتنی دروستدا ڕوودەدەن، گواستنەوەی یەکەم بۆ ژماردن بەکاردەهێنرێت بۆ دڵنیابوون لە تایبەتمەندی. کێوی ستانداردی MNA (کۆمپانیای کیمیایی توێژینەوەی تۆرۆنتۆ) بە شەش شلکردنەوەی زنجیرەیی گیراوەی کۆگا (1 میلیگرام/میلی لیتر) دروستکرا بۆ بەدەستهێنانی ستانداردەکانی 0.1، 1.0، 10 و 100 نانوگرەم/میلی لیتر و 1.0 و 10 میکرۆگرام/میلی لیتر بە ڕێککەوت شلە. سنووری دیاریکردن 1 نانوگرەم/میلی لیترە، و وەڵامی هێڵی لە نێوان 10 نانوگرەم/میلی لیتر و 10 میکرۆگرام/میلی لیترە. هەر دەرزییەک لە دوو مایکرۆلیتر لە نمونە و ستاندارد بۆ شیکاری LC/MS بەکاردەهێنرێت، و نمونەیەکی کۆنترۆڵکردنی کوالیتی تێکەڵاو لە هەر هەشت دەرزییەکدا بەڕێوەدەچێت بۆ دڵنیابوون لە سەقامگیری پلاتفۆرمی شیکاری. وەڵامەکانی MNAی هەموو نموونەکانی خانەکانی چارەسەرکراوی MNA لە مەودای هێڵی تاقیکردنەوەکەدا بوون. شیکاری داتاکان بە بەکارهێنانی نەرمەکاڵای شیکاری چەندایەتی MassHunter (v9.0، Agilent) ئەنجامدرا.
بنیاتنانی نەوەی دووەمی αFR-CAR لە Song et al. (59). بە کورتی، بنیاتەکە ئەم ناوەڕۆکانە لەخۆدەگرێت: زنجیرەی سەرکردەی CD8a، پارچە گۆڕاوە تاکە زنجیرەییە تایبەتەکانی αFRی مرۆڤ، هێنج و ناوچەی ترانزەمێمبرین CD8a، ناوچەی ناوخانەیی CD27 و ناوچەی ناوخانەیی CD3z. زنجیرەی تەواوی CAR بە GenScript دروستکرا، و پاشان کلۆن کرا بۆ ناو ڤێکتەری دەربڕینی ڤایرۆسی درێژخایەنی نەوەی دووەم لە سەرەوەی کاسێتی دەربڕینی GFP کە بۆ هەڵسەنگاندنی کارایی گواستنەوە بەکارهاتووە.
ڤایرۆسی درێژخایەن لە ڕێگەی گواستنەوەی خانەکانی HEK293T بەرهەم دێت [کۆکردنەوەی کشتوکاڵی جۆری ئەمریکی (ATCC); لە ناوەندی هەڵۆی دەستکاریکراوی دولبێکۆدا گەشە دەکات کە 10% سیرۆمی کۆرپەی گا (FBS) و 1% PenStrep لەخۆدەگرێت، و ڤێکتەری CAR-GFP بەکارهێنراوە و پلازمیدە پاکەتەکان (psPAX2 و pMD2.G، Addgene) ئەمینی چەوریفیکشن (Sigma-Aldrich) بەکاردەهێنن. شلەی سەرەوەی ڤایرۆسی تێدایە 48 و 72 کاتژمێر دوای گواستنەوە کۆکرایەوە، فلتەرکرا و بە ئۆڵتراسەنتەرفۆج چڕکرایەوە. شلەی سەرەوەی ڤایرۆسی چڕ لە پلەی گەرمی -80 پلەی سەدی هەڵبگرە تا گواستنەوە.
PBMC لە بەرهەمەکانی جیاکردنەوەی لیکۆسایتی بەخشەری تەندروست (STEMCELL Technologies) بە ڕێگەی سەنتەرفۆجکردنی چڕی گرادێنت فیکۆڵ جیا دەکرێنەوە. مایکرۆبیدەکانی CD8ی هەڵبژاردنی ئەرێنی (Miltenyi) بەکاربهێنە بۆ جیاکردنەوەی خانەکانی CD8+ لە PBMC. هاندانی خانەکانی T بە TransAct (Miltenyi) و لە ناوەندی TexMACS [Miltenyi; تەواوکەری 3% سیرۆمی مرۆڤی ناچالاککراوی گەرمی، 1% PenStrep و IL-2 (300 U/ml)]. بیست و چوار کاتژمێر دوای هاندانی، خانەکانی T بە ڤایرۆسی درێژخایەن (10 میکرۆلیتر سەرئاوی ڤایرۆسی چڕ بۆ هەر 106 خانەیەک) گواسترانەوە. 1 بۆ 3 ڕۆژ دوای گواستنەوە لەسەر سیتێک ئاورۆرا (لە سەر FSC (پەرشوبڵاوی پێشەوە)/SSC (پەرشوبڵاوی لایەنی)، سینگلێت، GFP+)، دەربڕینی GFPی خانەکان هەڵسەنگێنە بۆ نیشاندانی کارایی گواستنەوەی لانیکەم 30%.
خانەکانی CAR-T بۆ ماوەی 24 کاتژمێر لە Immunocult (STEMCELL Technologies؛ تەواوکەری 1% PenStrep) لە ژێر ئەم بارودۆخەی خوارەوەدا کشتوکاڵ کران: چارەسەرنەکراون، چارەسەرکراون بە 250 میکرۆمۆلی ئەدینۆسین یان 10 میلی مۆلی MNA. پاش پێش چارەسەرکردن، خانەکانی CAR-T بە PBS شۆردران و لەگەڵ 20,000 خانەکانی SK-OV-3 تێکەڵکران [ATCC؛ لە ناوەندی McCoy 5A (Sigma-Aldrich) کە بە 10% FBS و 1% PenStrep تەواوکراوە لە 10: ڕێژەی کاریگەر بۆ ئامانجی 1 بە سێ جار لە ناوەندی Immunocult تەواوکراودا گەورەکرا. خانەکانی SK-OV-3 و خانەکانی SK-OV-3 کە بە دیجیتالیس ساپۆنین (0.5mg/ml؛ Sigma-Aldrich) لایزە کراون وەک کۆنتڕۆڵی نەرێنی و ئەرێنی بەکارهێنران، بە ڕێککەوت. دوای 24 کاتژمێر لە هاوبەشی چاندن، شلەی سەرەوە کۆکرایەوە و لاکتات دیهایدرۆجیناز (LDH) بەپێی ڕێنماییەکانی بەرهەمهێنەر پێوانە کرا (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). شلەی سەرەوەی LDH بە 1:50 لە LDH بافەردا شلکرایەوە. ڕێژەی کوشتن بە بەکارهێنانی ئەم فۆرمولەیەی خوارەوە پێوانە کرا: ڕێژەی کوشتن = ڕێژەی سەدی ڕاستکردنەوە / زۆرترین ڕێژەی کوشتن x 100%، کە ڕێژەی سەدی ڕاستکردنەوە = تەنها خانەکانی هاوکلتوور-T، و زۆرترین ڕێژەی کوشتن = کۆنترۆڵی ئەرێنی-نەرێنی.
وەک لە دەق یان کەرەستە و شێوازەکاندا باسکراوە، بۆ شیکاری ئاماری GraphPad Prism 8، Microsoft Excel یان R v3.6.0 بەکاربهێنە. ئەگەر چەندین نمونە لە هەمان نەخۆش کۆبکرێنەوە (وەک ئاسیت و وەرەم)، ئێمە تاقیکردنەوەی t جووتە بەکاردەهێنین یان نەخۆشەکە وەک کاریگەرییەکی هەڕەمەکی لە مۆدێلێکی هێڵی یان گشتگیردا وەک گونجاو دەخەینە ناوەوە. بۆ شیکاری میتابۆلۆمیکس، تاقیکردنەوەی گرنگی بە سێ جار ئەنجام دەدرێت.
بۆ زانیاری تەواوکەر بۆ ئەم بابەتە، تکایە سەیری http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 بکەن
ئەمە بابەتێکی دەستڕاگەیشتنێکی کراوەیە کە بەپێی مەرجەکانی مۆڵەتی ئیسباتکردنی کرێتیڤ کۆمۆن-نابازرگانی دابەشکراوە، کە ڕێگە بە بەکارهێنان و دابەشکردن و دووبارە بەرهەمهێنانەوە دەدات لە هەر میدیایەکدا، بە مەرجێک بەکارهێنانی کۆتایی بۆ قازانجی بازرگانی نەبێت و پێشمەرجەکە ئەوەیە کە کارە ڕەسەنەکە ڕاست بێت. سەرچاوە.
تێبینی: تەنها داوات لێدەکەین ناونیشانی ئیمەیڵەکەت بدەیت بۆ ئەوەی ئەو کەسەی پێشنیاری دەکەیت بۆ پەیجەکە بزانێت کە تۆ دەتەوێت ئیمەیڵەکە ببینێت و سپام نییە. ئێمە هیچ ناونیشانێکی ئیمەیڵ ناگرین.
ئەم پرسیارە بەکاردێت بۆ تاقیکردنەوەی ئەوەی کە ئایا تۆ سەردانکەریت و ڕێگریکردن لە ناردنی سپام بە شێوەیەکی ئۆتۆماتیکی.
ماریسا ک.کیلگۆر (ماریسا ک. کیلگۆر)، سارا ماکفێرسۆن (سارا ماکفێرسۆن)، لۆرن جی.زاکاریا (لۆرێن جی.زاکاریا)، ئەبیگایل ئێلی ئاریس جی.واتسۆن (هـ.واتسۆن)، جۆن ستاگ (جۆن ستاگ)، براد ئێچ گ.جۆنز)، فینێس تی.هامیلتۆن (فینیاس تی.
MNA بەشدارە لە سەرکوتکردنی بەرگری خانەکانی T و نوێنەرایەتی ئامانجێکی چارەسەری بەرگری دەکات بۆ چارەسەرکردنی شێرپەنجەی مرۆڤ.
ماریسا ک.کیلگۆر (ماریسا ک. کیلگۆر)، سارا ماکفێرسۆن (سارا ماکفێرسۆن)، لۆرن جی.زاکاریا (لۆرێن جی.زاکاریا)، ئەبیگایل ئێلی ئاریس جی.واتسۆن (هـ.واتسۆن)، جۆن ستاگ (جۆن ستاگ)، براد ئێچ گ.جۆنز)، فینێس تی.هامیلتۆن (فینیاس تی.
MNA بەشدارە لە سەرکوتکردنی بەرگری خانەکانی T و نوێنەرایەتی ئامانجێکی چارەسەری بەرگری دەکات بۆ چارەسەرکردنی شێرپەنجەی مرۆڤ.
©2021 کۆمەڵەی ئەمریکی بۆ پێشخستنی زانست. هەموو مافەکان پارێزراوە. AAAS هاوبەشی کۆمپانیاکانی HINARI، AGORA، OARE، CHORUS، CLOCKSS، CrossRef و COUNTER ە. زانستی پێشکەوتن ISSN 2375-2548.