ڕیزکردنی پڕۆتینەکان لە ڕێڕەوی دەردراودا زۆر گرنگە بۆ پاراستنی بەشکردنی خانەکان و هێمۆستاسیس. جگە لە ڕیزکردنی بە ناوەندگیری توێکڵ، ڕۆڵی چەوریەکان لە ڕیزکردنی کینێسین لە پرۆسەی گواستنەوەی دەردراودا پرسیارێکی بنەڕەتی درێژخایەنە کە هێشتا وەڵام نەدراوەتەوە. لێرەدا، ئێمە وێنەگرتنی 3D هاوکاتی فرەڕەنگ بە ڕوونی بەرز لە کاتی ڕاستەقینەدا ئەنجام دەدەین بۆ ئەوەی لە ناو جەستەدا بیسەلمێنین کە پڕۆتینە تازە دروستکراوەکانی گلایکۆسیل فۆسفاتیدیلینۆسیتۆڵ-ناجووڵاو کە بەشە چەورییە زۆر درێژەکانی سیرامیدیان هەیە کۆکراونەتەوە و پۆلێنکراون بۆ ناوپۆشی تایبەتمەند شوێنی دەرچوونی تۆڕ، کە جیاوازە لەوەی کە لەلایەن پڕۆتینەکانی ترانزەمێمبرین بەکاردەهێنرێت. سەرەڕای ئەوە، ئێمە نیشان دەدەین کە درێژی زنجیرەی سیرامید لە پەردەی تۆڕی ئەندۆپلازمیدا گرینگە بۆ ئەم هەڵبژاردنی ڕیزکردنە. توێژینەوەکەمان یەکەم بەڵگەی ڕاستەوخۆ لە ناو جەستەدا دەدات بۆ پۆلێنکردنی باری پڕۆتینەکان لەسەر بنەمای درێژی زنجیرەی چەوری بۆ شوێنی هەناردەکردنی هەڵبژێردراو لە ڕێڕەوی دەردراودا.
لە خانە یۆکاریۆتییەکان، ئەو پڕۆتینانەی کە لە تۆڕی ئەندۆپلازمی (ER)دا دروستکراون، پاشان لە کاتی گواستنەوەدا لە ڕێگەی ڕێڕەوی دەردراوەوە ڕیز دەکرێن بۆ گەیاندن بۆ شوێنی مەبەستی خانەیی گونجاویان (1). جگە لە ڕیزکردنی بە ناوەندگیری پۆشاک، لە مێژە پێشبینی ئەوە دەکرا کە هەندێک چەوری دەتوانن وەک خاڵەکانی دەرچوونی هەڵبژێردراویش خزمەت بکەن بە کۆکردنەوەیان لە ناوچەی پەردەی تایبەت کە پڕۆتینە تایبەتەکان (2-5). بەڵام هێشتا کەمیی بەڵگەی ڕاستەوخۆ لە ناو جەستەدا هەیە بۆ سەلماندنی ئەم میکانیزمە ئەگەرییە لەسەر بنەمای چەوری. بۆ چارەسەرکردنی ئەم کێشە بنەڕەتییە، ئێمە لە مەعجووندا لێکۆڵینەوەمان کرد کە چۆن پڕۆتینە لەنگەری گلایکۆسیل فۆسفاتیدیلینۆسیتۆڵ (GPI) (GPI-APs) بە جیاوازی لە ER هەناردە دەکرێن. GPI-APs جۆرەها پڕۆتینی ڕووکاری خانەیی پەیوەست بە چەورییە (6، 7). GPI-AP پڕۆتینێکی دەردراوە کە لە ڕێگەی بەشە گلایکۆلیپیدەکانەوە (GPI anchor) بە پەرداخەکانی دەرەوەی پەردەی پلازما بەستراوەتەوە. ئەوان ئەنکرەکانی GPI وەک گۆڕانکاری کۆنەپەرستانەی دوای وەرگێڕان لە لومێنی ER وەرئەگرن (8). دوای لکاندنی، GPI-AP بە ئامێری گۆڵجی (5، 9) لە ER بۆ پەردەی پلازما تێدەپەڕێت. بوونی ئەنکرەکانی GPI دەبێتە هۆی گواستنەوەی GPI-AP بە جیا لە پڕۆتینە دەردراوەکانی ترانزەمێمبرین (لەوانەش پڕۆتینەکانی تری پەردەی پلازما) بە درێژایی ڕێڕەوی دەردراو (5، 9، 10). لە خانەکانی مەعجووندا، GPI-APs لە پڕۆتینە دەردراوەکانی تر لە تۆڕی ئەندۆپلازمیدا جیا دەکرێنەوە، و پاشان دەخرێنە ناو کیسەی ناوازەوە کە بە کۆمپلێکسی پڕۆتینی پۆشاک II (COPII) دەپێچرێتەوە (6، 7). دیاریکەرانی ئەم پرۆسەی پۆلێنکردنە لە پرۆسەی هەناردەکردنی ER ڕوون نین، بەڵام پێشبینی دەکرێت کە ئەم میکانیزمە ڕەنگە پێویستی بە چەوریەکان هەبێت، بە تایبەت دووبارە داڕشتنەوەی پێکهاتەی بەشی چەوری لەنگەری GPI (5، 8). لە مەعجووندا، دووبارە داڕشتنەوەی چەوری GPI ڕاستەوخۆ دوای لکاندنی GPI دەست پێدەکات، و لە زۆر حاڵەتدا، دەبێتە هۆی بەستنەوەی سیرامید بە ترشە چەورییە تێرەکانی زنجیرە درێژە 26 کاربۆنییەکان (C26:0) (11، 12). سیرامیدی C26 سیرامیدی سەرەکییە کە تا ئێستا لەلایەن خانەکانی مەعجوونەوە بەرهەم هێنراوە. لە ER دروست دەکرێت و زۆربەی لە ڕێگەی کیسەی COPII هەناردە دەکرێت بۆ ئامێری گۆڵجی (13). هەناردەکردنی ER ی GPI-AP بە تایبەتی پێویستی بە دروستکردنی سیرامیدی بەردەوام هەیە (14، 15)، و لە بەرامبەردا، گۆڕینی سیرامید بۆ سیرامیدی ئینۆسیتۆڵ فۆسفات (IPC) لە ئامێری گۆڵجیدا بەندە بە دروستکردنی لەنگەری GPI (16). توێژینەوە بایۆفیزیکییەکان لەگەڵ پەردەی دەستکرد دەریانخستووە کە سیرامیدە زنجیرە ئەسیلییە زۆر درێژەکان دەتوانن یەکبگرن بۆ پێکهێنانی دۆمەینی ڕێکخراو کە تایبەتمەندی فیزیایی ناوازەیان هەیە (17، 18). ئەم زانیاریانە دەبنە هۆی ئەو گریمانەیەی کە سیرامیدی C26 و GPI-AP لەگەڵ سیرامیدی C26 تایبەتمەندییە فیزیاییەکانیان بەکاردەهێنن بۆ یەکگرتنەوە بۆ ناوچە یان ناوچە ڕێک و پێکەکان لە ژینگەی چەوری پەردەی ER کە تاڕادەیەک ناڕێکخراوە. بە شێوەیەکی سەرەکی لە گلیسیرۆلیپیدە کورت و تێرنەکراوەکان پێکهاتووە (C16:1 و C18:1) (19، 20). ئەم ناوچانە بە شێوەیەکی هەڵبژێردراو لەسەر شوێنە تایبەتەکانی دەرچوونی ER (ERES) چڕ دەکرێنەوە، کە دەتوانرێت سیرامید و GPI-AP لەسەر بنەمای سیرامید بە هاوبەشی بگوازرێنەوە بۆ گۆڵجی لە هەمان کیسەی تایبەت بە COPII (5).
لەم لێکۆڵینەوەیەدا، ئێمە ڕاستەوخۆ ئەم میکانیزمە چەورییەمان تاقیکردۆتەوە بە بەکارهێنانی مایکرۆسکۆپی وێنەگرتنی کاتی ڕاستەقینەی کۆنفۆکاڵی وردبینییەکی سەروو (SCLIM)، کە تەکنیکێکی وردبینی پێشکەوتووە کە دەتوانێت لە یەک کاتدا چاودێری پڕۆتینەکانی ناونراو بە فلۆرۆسەنت بکات وێنە سێ ڕەنگ و سێ ڕەهەندییەکان (3D) ڕوونی و خێرایییەکی زۆر بەرزیان هەیە لە خانە زیندووەکاندا (21، 22).
ئێمە سەرەتا تەکنەلۆژیای SCLIMمان بەکارهێنا بۆ زیاتر پێناسەکردنی ئەوەی کە چۆن GPI-AP ئاسایی لەگەڵ گروپی سیرامیدی C26 لە پڕۆتینە دەردراوەکانی ترانزەمێمبرین سکرین کرا دوای جێهێشتنی ER لە S. cerevisiae. بۆ ئەوەی پۆلێنکردنی ER بپشکنین، ئێمە سیستەمێکی بۆماوەییمان بەکارهێنا کە دەتوانێت ڕاستەوخۆ باری تازە دروستکراو ببینێت کە دەچێتە ناو ERES لە ناو جەستەدا (7، 23). وەک بارهەڵگر، ئێمە GPI-AP Gas1ی بنەمادار بە سیرامیدی C26مان هەڵبژارد کە بە پڕۆتینی فلۆرۆسەنتی سەوز (GFP) و پڕۆتینی دەردراوی ترانزەمێمبرین Mid2 کە بە پڕۆتینی فلۆرۆسەنت ژێر سووری نزیک (iRFP) نیشانە کراوە، کە هەردووکیان پەردەی پلازما دەکەنە ئامانج (24-26). لە گۆڕاوی هەستیاری پلەی گەرمی sec31-1، ئەم دوو بارگەیە لە ژێر پرۆمۆتەرێکی هاندەری گالاکتۆز و نیشاندەری ERESی پێکهێنەردا دەربڕدراون. لە پلەی گەرمی زۆردا (37 پلەی سەدی)، لەبەر ئەوەی گۆڕانی sec31-1 کاریگەری لەسەر کارکردنی پێکهاتەی پۆششی COPII Sec31 هەیە بۆ ڕێگریکردن لە ڕواندنی COPII و هەناردەکردنی ER، باری تازە دروستکراو لە ER کۆدەبێتەوە (23). دوای ساردبوونەوە بۆ پلەی گەرمی نزم (24 پلەی سەدی)، خانە گۆڕاوەکانی sec31-1 لە ناوچەی دەردراو چاکبوونەوە، و باری نوێی دروستکراو کەڵەکەبوو لە ER دەستیان کرد بە هەناردەکردن. بینینی CLIM دەریخست کە زۆربەی Gas1-GFP و Mid2-iRFP تازە دروستکراوەکان هێشتا لە ERی خانە گۆڕاوەکانی sec31-1 کۆبوونەتەوە دوای کەرەوزکردن لە پلەی گەرمی 37 پلەی سەدی و پاشان لە پلەی گەرمی 24 پلەی سەدی بۆ ماوەی 5 خولەک ئازادکراون (شێوەی 1). بەو پێیەی Mid2-iRFP لەسەر تەواوی پەردەی ER دابەشکراوە، و Gas1-GFP لە ناوچەی پەردەی ER نابەردەوامدا چڕ بووەتەوە و کۆدەبێتەوە، دابەشبوونیان بە تەواوی جیاوازە (شێوەی 1، A تا C و فیلمی S1). سەرەڕای ئەوە، وەک لە وێنەی 1D دا نیشان دراوە، پۆلی Gas1-GFP Mid2-iRFP ی نییە. ئەم ئەنجامانە ئاماژە بەوە دەکەن کە GPI-AP و پڕۆتینەکانی ترانزەمێمبرین زوو جیاکراونەتەوە بۆ ناوچە جیاوازەکانی پەردەی ER. پۆلی Gas1-GFP تەنیشت ERES تایبەتە کە بە پڕۆتینی پۆششی COPII ی mCherry Sec13 ناوزەد کراوە (شێوەی 1، E و F، و فیلمی S1) (23).
خانەکانی sec31-1 دەردراوەکانی هاندەری گالاکتۆز دەرئەبڕن، زنجیرەیەکی درێژی ئەسیل (C26) سیرامید GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP، سەوز) و پڕۆتینی ترانزەمێمبرین Mid2-iRFP (TMP، شین) و ئەم ERES بنیاتنەرەی کە Sec13-mCherry (ERES، مەجنتا)ی نیشانە دەکات لە پلەی گەرمی 37 پلەی سەدی بۆ ماوەی 30 خولەک کەرەوزکرا بۆ 24°C، و وێنەی لەلایەن SCLIM 5 خولەک دواتر. . باری پێوەر 1μm (A و B). یەکەی پێوەرەکە 0.551μm (C) یە. Gas1-GFP لە ناوچە یان پۆلە جیاکراوەکانی ER دۆزراوەتەوە، لە کاتێکدا Mid2-iRFP دۆزراوەتەوە و بەسەر پەردەی ER دابەشکراوە (C). (D) گرافیکەکە توندی فلۆرۆسەنسی ڕێژەیی Gas1-GFP و Mid2-iRFP لە پۆلی Gas1-GFP بە درێژایی هێڵی تیری سپی (چەپ) نیشان دەدات. AU، یەکەیەکی ئارەزوومەندانە. (E و F) نوێنەرایەتی وێنەی سێ ڕەهەندی دەکەن کە کاڵاکان و نیشانەی ERES تێکەڵ دەکات. پۆلەکانی Gas1-GFP لە نزیک ERES تایبەت دۆزرانەوە. یەکەی پێوەرەکە 0.551μm یە. (F) تیری ڕەقی سپی پۆلی Gas1-GFP کە پەیوەندی بە ERESەوە هەیە دیاری دەکات. پانێڵی ناوەڕاست و ڕاست وێنەی سێ ڕەهەندی گەورەکراوی تێکەڵکراو و دیمەنێکی سووڕاوەی پۆلی هەڵبژێردراوی Gas1-GFP نیشان دەدەن.
پەیوەندی فەزایی نزیک لە نێوان پۆلی Gas1-GFP و ERES تایبەت ئاماژە بەوە دەکات کە Gas1-GFP دەتوانێت بچێتە ناو ERES هەڵبژێردراوەوە، کە جیاوازە لەو هەڵبژاردنەی کە لەلایەن Mid2-iRFP بۆ دەرچوون لە ER بەکاردەهێنرێت. بۆ چارەسەرکردنی ئەم ئەگەرە، ئێمە ڕێژەی ERESمان تەنها بۆ یەک یان دوو کاڵا ژمارەیی کرد (شێوەی ٢، A تا C). بۆمان دەرکەوت کە زۆربەی ERES (70%) تەنها یەک جۆری بار لەخۆدەگرێت. وێنەی خوارەوەی وێنەی 2C دوو نموونەی تایبەتی ERES نیشان دەدات کە تەنها Gas1-GFP (شێوەی 1) یان تەنها Mid2-iRFP (شێوەی 2)یان هەیە. لە بەرامبەردا، نزیکەی 20%ی ERES دوو باری تێدایە کە لە هەمان ناوچەدا سەریەک دەخەن. دەرکەوت کە هەندێک لە ERES (10%) دوو جۆر باری تێدایە، بەڵام لە ناوچە جیاوازەکانی ڕوون جیاکراونەتەوە. بۆیە، ئەم شیکارییە ئامارییە نیشان دەدات کە دوای هەناردەکردنی ER، GPI-AP Gas1-GFP و باری ترانزەمێمبرین Mid2-iRFP دابەش دەکرێن بەسەر ERES جیاوازەکاندا (شێوەی 2D). ئەم کاراییە ڕیزکردنە زۆر لەگەڵ شیکاری بایۆکیمیایی پێشوو (6) و دیاریکردنی مۆرفۆلۆژی (7) یەکدەگرێتەوە. هەروەها دەتوانین چاودێری هەڵسوکەوتی بارە کەرەنتینەکراوەکان بکەین کە دەچنە ناو ERES (شێوەی 2E و فیلمی S2). وێنەی 2E نیشان دەدات کە تەنها بەشێکی بچووک لە Gas1-GFP (پانێڵی 3) یان Mid2-iRFP (پانێڵی 4) لە لایەکەوە دەچێتە ناو ERES و لە ناوچەیەکی جیاوازدا قەتیس کراوە. پانێڵی 5ی وێنەی 2E نیشان دەدات کە Gas1-GFP و Mid2-iRFP هەندێک جار لە هەمان ERES دا دەبینرێن، بەڵام لە لایەنی جیاوازەوە دەچنە ژوورەوە و لە ناوچەی جیاوازدا چڕ دەبنەوە کە لەوانەیە نوێنەرایەتی کیسەی جیاوازی COPII بکەن. هەروەها ئێمە پشتڕاستمان کردەوە کە جیاکردنەوە و پۆلێنکردنی چاودێرکراوی GPI-AP Gas1 لەسەر بنەمای سیرامیدی C26 وەک ERES هەڵبژێردراو تایبەتە چونکە بارێکی دیکەی دەردانی ترانزەمێمبرین، پڕۆتینی پەردەی پلازمای GFP-تاگکراو Axl2 (27)، کە ڕەفتاری هاوشێوەی Mid2-iRFP نیشان دەدات. (وێنەی S1 و فیلمی S3). Axl2-GFP ی تازە دروستکراو لە ڕێگەی پەردەی ER وەک Mid2-iRFP دابەش دەکرێت (شێوەی S1، A و B)، و لەگەڵ Mid2-iRFP لە زۆربەی ERESدا هاوبەشە (شێوەی S1، B تا D). پانێڵی 1 و 2ی وێنەی 1. S1C دوو نموونەی تایبەتی ERES نیشان دەدات کە دوو باری ترانزەمێمبرین سەریەک دەخەن. لەم حاڵەتانەدا هەردوو کاڵاکە پێکەوە دەچنە ناو ERES (شێوەی S1E، پانێڵی 3 و فیلمی S3).
خانەکانی sec31-1 کە دەردانی گالاکتۆزی هاندەری دەربڕین، Gas1-GFP (GPI-AP، سەوز) و Mid2-iRFP (TMP، شین) و ERES پێکهێنەر بە ناوی Sec13-mCherry (ERES، مەجنتا) لە پلەی گەرمی 37 دانران دوای کەرەوزکردن بۆ ماوەی 30 خولەک لە پلەی سەدی، بگوازرێنەوە بۆ پلەی گەرمی 24 پلەی سەدی بۆ ئازادکردنی بلۆکی دەردانەکە، و وێنەگرتن لەگەڵ SCLIM دوای ٢٠ خولەک. (A تا C) وێنەی نوێنەری پێشبینیکردنی دوو ڕوویی (A؛ باری پێوەر، 1μm) یان وێنەی سێ ڕەهەندی نیوەگۆی خانە (B و C؛ یەکەی پێوەر، 0.456μm)ی بارەکە و 10 بەشی z کە بە ERES نیشانە کراون. پانێڵی خوارەوە لە (B) و پانێڵی (C) وێنەی پرۆسێسکراو پیشان دەدەن بۆ پیشاندانی تەنها ئەو کاڵایانەی کە لە ERES (مەجنتا)دا هەن [Gas1-GFP (خۆڵەمێشی) و Mid2-iRFP (شینێکی سووک)]. (C) تیری کراوە: ERES تەنها یەک پارچە بار هەڵدەگرێت (1 بۆ 4). تیری خۆڵەمێشی: ERES باری جیاکراوەی تێدایە (5). تیری ڕەقی سپی: ERES کە باری هاوبەشی تێدایە. لە خوارەوە: تاکە ERES هەڵبژێردراو تەنها Gas1-GFP (1) یان Mid2-iRFP (2) لەخۆدەگرێت. باری پێوەر، 100 نانۆمەتر. (D) ژماردن و دیاریکردنی فۆتۆمایکرۆگرافی کە لە (C)دا باسکراوە. تێکڕای ڕێژەی سەدی ERES کە تەنها یەک بار لەخۆدەگرێت (Gas1-GFP یان Mid2-iRFP)، باری جیاکراوە و باری سەریەککەوتوو. لە سێ تاقیکردنەوەی سەربەخۆدا، n=432 لە 54 خانەدا. باری هەڵە = SD. تاقیکردنەوەی t دوو کلکی جووت نەکراو. *** P = 0.0002. (E) وێنەی سێ ڕەهەندی ERES هەڵبژێردراوی باری کەرەنتینەکراو کە بە (C) نیشانە کراوە. Gas1-GFP (سەوز) (3) یان Mid2-iRFP (شین) (4) لە لایەکەوە دەچێتە ناو ERES (مەجنتا) و سنووردارە بە ناوچەیەکی بچووک لە ناو ERES. هەندێک جار، هەردوو جۆری بار لە هەمان لاوە دەچنە ناو هەمان ERES (5) و لە ناوچەیەکی دابڕاو لە ناو ERESدا قەتیس دەکرێن. باری پێوەر، 100 نانۆمەتر.
دواتر، ئێمە گریمانەیەکمان تاقیکردەوە کە سیرامیدی زنجیرە ئەسیل درێژەکە (C26) کە لە پەردەی ERدا هەیە، کۆکردنەوە و ڕیزکردنی تایبەتی Gas1 دەباتە ناو ERES هەڵبژێردراوەوە. بۆ ئەم مەبەستە، ئێمە جۆرێکی مەعجوونی دەستکاریکراومان GhLag1 بەکارهێنا، کە تێیدا دوو سیرامید سینتازە ناوخۆییەکانی Lag1 و Lac1 بە GhLag1 (هاومۆلۆگی Lag1ی پەتاتە) جێگیرکران، لە ئەنجامدا جۆرێکی مەعجوون کە پەردەی خانەیی جۆری Ceramide کورتتر بوو لە جۆری کێوی (شێوەی 3A) (28). شیکاری سپێکترۆمێتری بارستەیی (MS) دەریخست کە لە جۆرە کێوییەکاندا، 95%ی کۆی سیرامیدەکە سیرامیدی زنجیرەی زۆر درێژە (C26)، لەکاتێکدا لە GhLag1دا، 85%ی سیرامیدەکە زۆر درێژە (C18 و C16). )، تەنها 2%ی سیرامید سیرامیدی زنجیرەی زۆر درێژە (C26). هەرچەندە سیرامیدەکانی C18 و C16 سیرامیدە سەرەکییەکانن کە تا ئێستا لە پەردەی GhLag1دا دۆزراونەتەوە، بەڵام شیکاری MS هەروەها پشتڕاستی کردەوە کە لەنگەری GPI ی Gas1-GFP کە لە جۆری GhLag1 دەربڕدراوە سیرامیدی C26ی تێدایە، کە بەراورد دەکرێت بە چەوری جۆری کێوی. کوالیتی وەک یەکە (شێوەی 3A) (26). بۆیە ئەمە بەو مانایەیە کە ئەنزیمەکانی دووبارە داڕشتنەوەی سیرامید Cwh43 زۆر هەڵبژێردراوە بۆ سیرامیدی C26، وەک لە وێنەی 26 دا نیشان دراوە، بە پەسەندکردن لەنگەری GPI لە بڕێکی کەم لە سیرامیدی C26 لە جۆری GhLag1 تێکەڵ دەکات. S2 (29). سەرەڕای ئەوەش، پەردەی خانەیی GhLag1 لە بنەڕەتدا تەنها سیرامیدی C18-C16 لەخۆدەگرێت، لە کاتێکدا Gas1-GFP هێشتا سیرامیدی C26ی هەیە. ئەم ڕاستییە ئەم جۆرە دەکاتە ئامرازێکی ئایدیاڵ بۆ چارەسەرکردنی کێشەی درێژی زنجیرە ئەسیلییەکانی سیرامیدی پەردە لە ER. ڕۆڵی گریمانەیی چینایەتی و ڕیزکردن. پاشان، ئێمە سەرەتا لێکۆڵینەوەمان لە توانای C26 Gas1-GFP کرد بۆ کۆبوونەوە لە پۆلەکاندا لە GhLag1 لەگەڵ ئالێلی گۆڕاوی هەستیاری پلەی گەرمی sec31-1 لە ڕێگەی مایکرۆسکۆپی فلۆرۆسەنسی ئاسایی، کە تەنها زنجیرە درێژەکە (C18-C16) لە پەردەی ER Ceramide بوونی هەیە (شێوەی 3). ئێمە تێبینیمان کرد کە لە sec31-1، زۆربەی Gas1-GFP لە پۆلەکاندا چڕ بووەوە، لە کاتێکدا Gas1-GFP لە sec31-1 GhLag1 لەگەڵ پەردەی درێژ (C18-C16) درێژی سیرامیدی ER بە شێوەیەکی سەرەکی کۆ نەبووەتەوە و لە تەواوی پەردەی ER دابەش نەبووە. بۆ وردبینی، لەبەر ئەوەی کۆکردنەوە لەسەر بنەمای سیرامیدی C26 پەیوەندییەکی نزیک بە ERES تایبەتەوە هەیە (شێوەی 1)، دواتر لێکۆڵینەوەمان کرد کە ئایا ئەم پرۆسەیە ڕەنگە ئەرکی میکانیزمی پڕۆتینی هەناردەکردنی ERیش لەخۆبگرێت. GPI-AP سیستەمێکی تایبەتی COPII بۆ هەناردەکردنی ER بەکاردەهێنێت، کە چالاکانە بەهۆی دووبارە داڕشتنەوەی پێکهاتەی Ted1ی بەشی گلایکانی لەنگەری GPI ڕێکدەخرێت (30، 31). پاشان GPI-گلایکانی پێکەوەلکاو لەلایەن کۆمپلێکسی وەرگری باری ترانزەمێمبرین p24 دەناسرێتەوە، کە لە بەرامبەردا بە شێوەیەکی هەڵبژێردراو Lst1 وەرئەگرێت، کە ئایزۆفۆڕمێکی تایبەتی ژێر یەکەی بەستنەوەی باری سەرەکی COPII Sec24 ە، کە پێکهێنانی COPII دەوڵەمەند بە GPI-AP کیسەڵەکان پێویستە (31-33). بۆیە، ئێمە دوو گۆڕاوێکمان دروستکرد کە سڕینەوەی ئەم تاکە پڕۆتینانە (پێکهاتەی ئاڵۆزی p24 Emp24، ئەنزیمەکانی دووبارە داڕشتنەوەی GPI-گلایکان Ted1 و ژێر یەکەی تایبەتی COPII Lst1) لەگەڵ جۆری گۆڕاوی sec31-1 تێکەڵ کرد، و لێکۆڵینەوەمان لەسەریان کرد ئایا دەتوانرێت Gas1-cluster GFP دروست بکرێت (شێوەی 3). ئێمە تێبینیمان کرد کە لە sec31-1emp24Δ و sec31-1ted1Δ، Gas1-GFP بە شێوەیەکی سەرەکی کۆنەکراوە و دابەشکراوە بەسەر سەرتاسەری پەردەی ER، وەک پێشتر لە sec31-1 GhLag1دا بینراوە، لە کاتێکدا لە sec31-1lst1Δ، Gas1-GFP وەک sec31-1. ئەم ئەنجامانە ئاماژە بەوە دەکەن کە جگە لە بوونی سیرامیدی C26 لە پەردەی ER، کۆکردنەوەی Gas1-GFP پێویستی بە بەستنەوە هەیە بە کۆمپلێکسی p24، و پێویستی بە وەرگرتنی تایبەتی Lst1 نییە. پاشان، ئێمە ئەگەری ئەوەمان لێکۆڵیەوە کە درێژی زنجیرەی سیرامید لە پەردەی ER دەتوانێت بەستنەوەی Gas1-GFP بە p24 ڕێکبخات. بەڵام، بۆمان دەرکەوت کە بوونی سیرامیدی C18-C16 لە پەردەکەدا کاریگەری لەسەر GPI-گلایکانەکان نییە کە لەلایەن کۆمپلێکسی p24 دروستکراونەتەوە (شێوەی S3 و S4، A و B) یان بەستنەوە بە GPI-AP و هەناردەکردنی GPI-AP. توانا. ژێر جۆری COPII Lst1 وەربگرە (شێوەی S4C). بۆیە، کۆکردنەوەی وابەستە بە سیرامیدی C26 پێویستی بە کارلێکی پڕۆتین نییە لەگەڵ میکانیزمە جیاوازەکانی پڕۆتینی هەناردەکردنی ER، بەڵام پشتگیری لە میکانیزمێکی ڕیزکردنی بەدیل دەکات کە بەهۆی درێژی چەورییەوە دەجووڵێت. پاشان، ئێمە شیکاریمان کرد کە ئایا درێژی زنجیرەی ئەسیل سیرامید لە پەردەی ER گرنگە بۆ پۆلێنکردنی کاریگەرانەی Gas1-GFP وەک ERES هەڵبژێردراو. بەو پێیەی Gas1 لە جۆری GhLag1 لەگەڵ سیرامیدی زنجیرە کورت ER بەجێدەهێڵێت و دەچێتە ناو پەردەی پلازما (شێوەی S5)، ئێمە پێمان وایە کە ئەگەر ڕیزکردنەکە بەهۆی درێژی زنجیرەی ئەسیل سیرامیدەوە بێت، دەتوانرێت Gas1 لە جۆری GhLag1 ئاڕاستە بکرێتەوە و ببڕدرێت. کاڵاکانی ERES بە هەمان پەردەوە.
(A) پەردەی خانەیی GhLag1 بە شێوەیەکی سەرەکی سیرامیدە کورتەکانی C18-C16 لەخۆدەگرێت، لە کاتێکدا کە لەنگەری GPIی Gas1-GFP هێشتا هەمان C26 IPCی خانەکانی جۆری کێوی هەیە. لە سەرەوە: شیکاری درێژی زنجیرەی ئەسیلی سیرامید لە پەردەی خانەکانی جۆرە کێوییەکان (Wt) و GhLag1p بە سپێکترۆمێتری بارستەیی (MS). داتاکان ڕێژەی سەدی کۆی گشتی سیرامید نیشان دەدەن. تێکڕای سێ تاقیکردنەوەی سەربەخۆ. باری هەڵە = SD. تاقیکردنەوەی t دوو کلکی جووت نەکراو. **** P <0.0001. پانێڵی خوارەوە: شیکاری MS بۆ درێژی زنجیرە ئەسیلەکانی IPC کە لە لەنگەری GPI Gas1-GFP (GPI-IPC)دا هەیە کە لە جۆرە کێوییەکان و GhLag1p دەربڕدراوە. داتاکان ڕێژەی سەدی کۆی سیگناڵی IPC نیشان دەدەن. تێکڕای پێنج تاقیکردنەوەی سەربەخۆ. باری هەڵە = SD. تاقیکردنەوەی t دوو کلکی جووت نەکراو. ns، گرنگ نییە. P = 0.9134. (B) Fluorescence micrographs of sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ and sec31-1lst1Δ cells expressing galactose-induced Gas1-GFP were incubated at 37°C for 30 minutes and passed down to Perform routine fluorescence microscopy after ٢٤ پلەی سەدی. تیری سپی: پۆلی ER Gas1-GFP. تیری کراوە: Gas1-GFP ی کۆکراوە لەسەر تەواوی پەردەی ER دابەشکراوە، کە ڕەنگکردنی ئەڵقەی ناوکی تایبەتمەندی ER نیشان دەدات. باری پێوەر، 5μm. (C) ژماردن و دیاریکردنی فۆتۆمایکرۆگرافی کە لە (B)دا باسکراوە. تێکڕای ڕێژەی سەدی خانەکان کە پێکهاتەی خاڵی Gas1-GFP یان هەیە. لە سێ تاقیکردنەوەی سەربەخۆدا، n≥300 خانە. باری هەڵە = SD. تاقیکردنەوەی t دوو کلکی جووت نەکراو. **** P <0.0001.
بۆ چارەسەرکردنی ڕاستەوخۆی ئەم کێشەیە، ئێمە بینینی SCLIMمان بۆ Gas1-GFP و Mid2-iRFP لە GhLag1 لەگەڵ ئالێلی گۆڕاوی هەستیاری پلەی گەرمی sec31-1 ئەنجامدا (شێوەی 4 و فیلمی S4). دوای ئەوەی ER لە پلەی گەرمی 37 پلەی سەدیدا ڕاگیرا و دواتر لە پلەی گەرمی 24 پلەی سەدیدا ئازادکرا، زۆربەی Gas1-GFPی تازە دروستکراو کۆ نەکرایەوە و بەسەر پەردەی ERدا دابەش نەکرا، وەک لە ڕێگەی مایکرۆسکۆپی ئاساییەوە بینرا (شێوەی 4، A و B). سەرەڕای ئەوە، ڕێژەیەکی زۆر لە ERES (67%) دوو جۆر بارهەڵگر لەخۆدەگرێت کە هاوبەشن تێیدا (شێوەی 4D). پانێڵی 1 و 2ی وێنەی 4C دوو نموونەی تایبەتی ERES نیشان دەدەن لەگەڵ Gas1-GFP و Mid2-GFP کە سەریەککەوتوون. سەرەڕای ئەوەش، هەردوو کاڵاکە لە هەمان ERES وەرگیران (شێوەی 4E، پانێڵی 3 و فیلمی S4). بۆیە ئەنجامەکانمان ئاماژە بەوە دەکەن کە درێژی زنجیرەی ئەسیل سیرامید لە پەردەی ER دیاریکەرێکی گرنگە بۆ کۆبوونەوە و پۆلێنکردنی پڕۆتینی ER.
خانەکانی Sec31-1 GhLag1 کە دەردراوەکانی هاندەری گالاکتۆز، Gas1-GFP (GPI-AP، سەوز) و Mid2-iRFP (TMP، شین) و پێکهێنەر ERES-نیشانەی Sec13-mCherry (ERES، مەجنتا) دەرئەبڕن لە پلەی گەرمی 37 پلەی سەدیدا کەرەوز دەکرێن. بۆ ماوەی ٣٠ خولەک بەردەوام بە، دابەزێنە بۆ پلەی گەرمی ٢٤ پلەی سەدی بۆ دەردانی دەردراوەکان، و وێنەگرتن بە SCLIM دوای ٢٠ خولەک. (A تا C) وێنەی نوێنەری پێشبینیکردنی دوو ڕوویی (A؛ باری پێوەر، 1 میکرۆمتر) یان وێنەی سێ ڕەهەندی نیوەگۆی خانە (B و C؛ یەکەی پێوەر، 0.45μm) لە 10 بەشە z کە بە بارهەڵگر و ERES نیشانە کراون. پانێڵی خوارەوە لە (B) و پانێڵی (C) وێنەی پرۆسێسکراو پیشان دەدەن بۆ پیشاندانی تەنها ئەو کاڵایانەی کە لە ERES (مەجنتا)دا هەن [Gas1-GFP (خۆڵەمێشی) و Mid2-iRFP (شینێکی سووک)]. (C) تیری پڕکراوی سپی: ERES، کاڵاکان سەریەک دەخەن. تیری کراوە: ERES تەنها یەک بابەتی تێدایە. پانێڵی خوارەوە: ERES هەڵبژێردراو کاڵای سەریەککەوتووی (1 و 2)ی هەیە کە لە (C)دا نیشانە کراون. باری پێوەر، 100 نانۆمەتر. (D) ژماردن و دیاریکردنی فۆتۆمایکرۆگرافی کە لە (C)دا باسکراوە. لە یەکەکانی sec31-1 و sec31-1 GhLag1، تەنها یەک بار (Gas1-GFP یان Mid2-iRFP) لەخۆدەگرێت، و تێکڕای ڕێژەی سەدی ERES بۆ باری جیاکراوە و باری سەریەککەوتوو. لە سێ تاقیکردنەوەی سەربەخۆدا، n = 432 لە 54 خانەدا (sec31-1) و n = 430 لە 47 خانەدا (sec31-1 GhLag1). باری هەڵە = SD. تاقیکردنەوەی t دوو کلکی جووت نەکراو. *** P = 0.0002 (sec31-1) و ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) وێنەی سێ ڕەهەندی ERES هەڵبژێردراو لەگەڵ باری سەریەککەوتوو (3) کە لە (C)دا نیشانە کراوە. Gas1-GFP (سەوز) و Mid2-iRFP (شین) لە هەمان لاوە لە ERES (مەجنتا) نزیک دەبنەوە و لە هەمان ناوچەی سنووردارکراوی ERES دەمێننەوە. باری پێوەر، 100 نانۆمەتر.
ئەم توێژینەوەیە بەڵگەی ڕاستەوخۆ لە ناو جەستەدا دەدات کە باری پڕۆتینی بنەمادار بە چەوری پۆلێن دەکرێن بۆ شوێنی هەناردەکردنی هەڵبژێردراو لە ڕێڕەوی دەردراودا، و گرنگی درێژی زنجیرەی ئەسیل بۆ هەڵبژاردنی پۆلێنکردن ئاشکرا دەکات. بە بەکارهێنانی تەکنیکێکی بەهێز و پێشکەوتووی وردبینی بە ناوی SCLIM، ئێمە Gas1-GFP ی تازە دروستکراومان نیشان دا (پەردەیەکی سەرەکی پلازما GPI-AP لەگەڵ زنجیرەیەکی زۆر درێژی ئەسیل (C26) بەشی چەوری سیرامید) لە مەعجوون) ئەو ناوچانەی کە لە ER جیاکراوەکاندا کۆبوونەتەوە پەیوەندییان بە ERES تایبەتەوە هەیە، لە کاتێکدا پڕۆتینە دەردراوەکانی ترانزەمێمبرین لە سەرانسەری پەردەی ER دابەشکراون (شێوەی یەکەم). سەرەڕای ئەوەش، ئەم دوو جۆرە کاڵایە بە شێوەیەکی هەڵبژێردراو دەچنە ناو ERES جیاوازەکانەوە (شێوەی ٢). درێژی زنجیرە ئەسیلییەکانی سیرامیدی خانەیی لە پەردەکەدا لە C26 بۆ C18-C16 کەم دەبێتەوە، پۆلی Gas1-GFP تێکدەچێت بۆ ناوچەی ERی جیاکراوە، و Gas1-GFP ڕێڕەو دەکرێتەوە بۆ ئەوەی ER لەگەڵ پڕۆتینی ترانزەمێمبرین بەجێبهێڵێت لە ڕێگەی هەمان ERES (شێوەی 3 و وێنەی 3). 4).
هەرچەندە GPI-AP میکانیزمێکی پڕۆتینی تایبەتمەند بەکاردەهێنێت بۆ دەرچوون لە ER، بەڵام بۆمان دەرکەوت کە جیاکردنەوەی وابەستە بە سیرامیدی C26 پشت بە کارلێکە جیاوازەکانی پڕۆتین نابەستێت کە ڕەنگە ببێتە هۆی تایبەتمەندبوونی ERES (شێوەکانی S4 و S5). لەبری ئەوە، دۆزینەوەکانمان پشتگیری لە میکانیزمێکی پۆلێنکردنی بەدیل دەکەن کە بەهۆی کۆکردنەوەی پڕۆتینەکانی بنەمای چەوری و دواتر دەرکردنی بارەکانی ترەوە دەجووڵێتەوە. تێبینییەکانمان ئاماژە بەوە دەکەن کە ناوچەی Gas1-GFP یان پۆلی پەیوەست بە ERES تایبەتەوە پڕۆتینی دەردراوی ترانزەمێمبرینی Mid2-iRFPی نییە، ئەمەش ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە پۆلی GPI-AP وابەستە بە سیرامیدی C26 ئاسانکاری دەکات بۆ چوونە ژوورەوەیان بۆ ناو ERES پەیوەندیدار، و لە هەمان کاتدا، دەردراوەکانی ترانزەمێمبرین دەچنە ناو ئەم ERES تایبەتەوە (شێوەی 1 و 2). لە بەرامبەردا، بوونی سیرامیدەکانی C18-C16 لە پەردەی ER نابێتە هۆی ئەوەی GPI-AP ناوچە یان پۆل دروست بکات، بۆیە پڕۆتینەکانی دەردراوی ترانزەمێمبرین بەدەر ناکەن یان جێگەیان ناگرنەوە بۆ هەمان ERES (شێوەی 3 و 4). . بۆیە، ئێمە پێشنیار دەکەین کە سیرامیدی C26 جیاکردنەوە و پۆلێنکردن دەباتە پێشەوە بە ئاسانکاری بۆ کۆکردنەوەی پڕۆتینەکانی پەیوەست بە ERES تایبەت.
چۆن ئەم کۆکردنەوە وابەستە بە سیرامیدی C26 لە ناوچەیەکی دیاریکراوی ER بەدەست بهێنین؟ مەیلی جیابوونەوەی سیرامیدی پەردە بە شێوەی لایەنی لەوانەیە ببێتە هۆی دروستکردنی چەوری بچووک و چرکەساتی ڕێکخراو لە ژینگەی چەوری ناڕێکتری پەردەی ER کە چەوری گلیسیرۆلیپیدی کورتتر و تێرنەکراوی تێدایە. پۆلەکانی کوالیتی (17، 18). ئەم پۆلە کاتییە بچووکانە دەتوانرێت زیاتر تێکەڵ بکرێن بۆ پۆلە گەورەتر و جێگیرترەکان دوای بەستنەوەیان بە کۆمپلێکسی p24 (34). بەگوێرەی ئەمە، ئێمە نیشانمان دا کە C26 Gas1-GFP پێویستی بە کارلێککردنە لەگەڵ کۆمپلێکسی p24 بۆ پێکهێنانی پۆلی بینراوی گەورەتر (شێوەی 3). کۆمپلێکسی p24 ئۆلیگۆمێرێکی جیاوازە کە پێکهاتووە لە چوار پڕۆتینی جیاوازی p24 ترانزەمێمبرین لە مەعجوون (35)، کە بەستنەوەی فرە وەلێنت دابین دەکات، کە دەتوانێت ببێتە هۆی پەیوەندی بڕبڕەیی پۆلە بچووکەکانی GPI-AP، بەمەش پۆلێکی گەورەتری جێگیر دروست دەکات (34). هەروەها کارلێکی نێوان دۆمەینی دەرەوەی پڕۆتینی GPI-APs ڕەنگە بەشداربێت لە کۆبوونەوەیان، وەک لە کاتی گواستنەوەی گۆڵجییان لە خانە جەمسەرییەکانی پۆششی شیردەرەکاندا نیشان دراوە (36). بەڵام کاتێک سیرامیدی C18-C16 لە پەردەی ERدا هەبێت، کاتێک کۆمپلێکسی p24 بە Gas1-GFP دەبەسترێتەوە، پۆلی جیاوازی گەورەی جیاواز دروست نابێت. میکانیزمی بنەڕەتی لەوانەیە پشت بە تایبەتمەندییە فیزیایی و کیمیاییە تایبەتەکانی سیرامیدی زنجیرە ئەسیل درێژەکە ببەستێت. توێژینەوە بایۆفیزیکییەکانی پەردەی دەستکرد دەریدەخەن کە هەرچەندە هەردوو سیرامیدی زنجیرە ئەسیل درێژەکان (C24) و کورتەکان (C18-C16) دەتوانن ببنە هۆی جیابوونەوەی قۆناغەکان، بەڵام تەنها سیرامیدەکانی زنجیرە ئەسیل درێژەکان (C24) دەتوانن بەرەوپێشبردنی Curvature بەرز و چەمانەوەی فیلمەکە بەرەوپێش ببەن بۆ دووبارە شێوەدانەوەی فیلمەکە. لە ڕێگەی ئاماژەی یەکترەوە (17، 37، 38). دەرکەوتووە کە هێلیکسی ترانزەمێمبرینی TMED2، هۆمۆلۆگی مرۆڤی Emp24، بە شێوەیەکی هەڵبژێردراو لەگەڵ ئیسفینگۆمایلین لەسەر بنەمای سیرامیدی C18 لە لوولەکانی سایتوبڵازمیدا کارلێک دەکات (39). بە بەکارهێنانی ھاوشێوەکردنی داینامیکی گەردیلەیی (MD)، بۆمان دەرکەوت کە هەردوو سیرامیدی C18 و C26 لە دەوری لوولەکانی سایتوبڵازمای هێلیکسی ترانزەمێمبرینی Emp24 کۆدەبنەوە، و ئەوان ئارەزووی هاوشێوەیان هەیە (شێوەی S6). شایەنی باسە کە ئەمە ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە هێلیکسی ترانزەمێمبرینی Emp24 دەتوانێت ببێتە هۆی دابەشبوونی ناهاوسەنگی چەورییەکان لە پەردەکەدا. ئەمەش ئەنجامێکی ئەم دواییە لەسەر بنەمای خانەکانی شیردەرەکان. هەروەها ھاوشێوەکردنی هاوشێوەی MD بوونی چەوری ئیتەر نیشان دەدات (40). بۆیە ئێمە گریمانە دەکەین کە سیرامیدی C26 لە دوو لوولەی ER26 لە ڕووی ناوخۆییەوە دەوڵەمەند کراوە. کاتێک GPI-AP لە لومیناڵ لۆبولەکاندا ڕاستەوخۆ دەبەسترێتەوە بە p24 فرە وەلێنتی و کۆبوونەوەی سیرامیدی C26 لە دەوروبەری p24 لە لۆبولی سیتۆپلازمی، دەتوانێت کۆبوونەوەی پڕۆتینی هاوڕێی بەرەوپێش ببات و کێشانی پەردە لە ڕێگەی پەنجەکانەوە دروست دەبێت (41)، ئەمەش دەبێتە هۆی جیابوونەوەی GPI-AP بۆ ناوچە جیاکراوەکانی تەنیشت ERES، کە هەروەها لە بەرژەوەندی زۆر کێشراوەکانە ناوچەکانی پەردەی ER (42). ڕاپۆرتەکانی پێشوو پشتگیریان لە میکانیزمی پێشنیارکراوی کردووە (43، 44). بەستنەوەی فرە وەلێنتی ئۆلیگۆلێکتینەکان، ماددە نەخۆشخوازەکان یان دژەتەنەکان بە گلایکۆسفینگۆلیپیدەکانی بنەمای سیرامید (GSL) لەسەر پەردەی پلازما کۆبوونەوەی گەورەی GSL دەستپێدەکات، جیاکردنەوەی قۆناغەکان بەرز دەکاتەوە و دەبێتە هۆی شێواندن و ناوەکیکردنی پەردە (44). ئیوابوچی و هتد نیوترۆفیلەکان.
لە خانە جەمسەرییەکانی پۆششی شیردەرەکاندا، چڕیی تۆڕی دژە گۆڵجی (TGN) تا ئاستی پەردەی پلازمای سەرەوە جیابوونەوە و ڕیزکردنی GPI-AP کۆنتڕۆڵ دەکات (10، 45). ئەم کۆبوونەوەیە بەهۆی ئۆلیگۆمێرکردنی GPI-APەوە دەجووڵێتەوە (36)، بەڵام ڕەنگە پەیوەست بێت بە درێژی زنجیرەی سیرامید کە لە مەعجووندا دەیدۆزینەوە. هەرچەندە شیردەرەکان GPI-AP خاوەنی ئەنکرێکی بنەمای چەوری ئیتەرە، و پێکهاتەی کیمیاییەکەی زۆر جیاوازە لە زنجیرەی ئەسیلی زۆر درێژ سیرامید، بەڵام لێکۆڵینەوەیەکی ئەم دواییە دەریخست کە هەردوو چەورییەکە لە ڕووی پەرەسەندنەوە تایبەتمەندی فیزیایی و کیمیایی هاوشێوەیان هەیە و کارکردنیان هەیە (40). بۆیە، بەشی چەوری ئیتەر لە خانەکانی شیردەرەکاندا ڕەنگە هاوشێوەی سیرامیدی C26 لە مەعجوونەکاندا بێت، و ڕۆڵی پەیوەندیکردنە لەگەڵ سیرامیدی زنجیرە درێژەکان لە پەردەکەدا بۆ پێشخستنی کۆبوونەوە و ڕیزکردنی GPI-AP. هەرچەندە ئەم ئەگەرە هێشتا پێویستی بە تاقیکردنەوەی ڕاستەوخۆ هەیە، بەڵام دۆزینەوەکانی پێشوو پشتگیری لەوە دەکەن کە گواستنەوەی سیرامیدی زنجیرە ئەسیل درێژەکە بۆ جەستەی گۆڵجی لەلایەن پڕۆتینەکانی گواستنەوەی سایتوبڵازمیەوە ئەنجام نادرێت، بەڵکو بەندە بە دروستکردنی ئەنکرەکانی GPI وەک مەعجوون. بۆیە، پێدەچێت میکانیزمی کۆنەپەرستانەی پەرەسەندن بتوانێت بە شێوەیەکی هەڵبژێردراو هاوبەشی گواستنەوەی سیرامیدی زنجیرە ئەسیلییە زۆر درێژەکان و GPI-AP (13، 16، 20، 46، 47) لە هەمان کیسەی گواستنەوەدا.
لە سیستەمی خانەکانی پۆششی جەمسەری مەعجوون و شیردەرەکاندا، کۆبوونەوەی GPI-AP و جیابوونەوە لە پڕۆتینەکانی تری پەردەی پلازما هەموویان پێش ئەوەی بگاتە ڕووی خانەکە ڕوودەدەن. پالادینۆ و هاوکارانی. (48) بۆیان دەرکەوت کە لەسەر TGNی خانە جەمسەرییەکانی پۆششی شیردەرەکان، کۆکردنەوەی GPI-AP نەک تەنها پێویستە بۆ پۆلێنکردنی هەڵبژێردراوی GPI-APs بۆ پەردەی پلازمای سەرەوە، بەڵکو ڕێکخستنی کۆکردنەوەی GPI-APs و چالاکییە بایۆلۆژییەکەی ڕێکدەخات. ڕووی خانە. لە مەعجووندا، ئەم توێژینەوەیە دەریخست کە پۆلی GPI-AP وابەستە بە سیرامیدی C26 لەسەر ER دەتوانێت ڕێکخستنی پۆل و چالاکیی کارایی GPI-AP لەسەر پەردەی پلازما ڕێکبخات (24، 49). بەگوێرەی ئەم مۆدێلە، خانەکانی GhLag1 حەساسیەتیان هەیە بە ڕێگریکەرانی GPI یان ئەو دەرمانانەی کە کاریگەرییان لەسەر یەکپارچەیی دیواری خانەکان هەیە (28)، و پێویستی بە پۆلەکانی کارایی Gas1-GFP (49)ی سیرامیدی نووک کە لە جووتبوونی خانەکانی مەعجووندا پێشبینی کراوە ئاماژەیە بۆ G دەرئەنجامە فیزیۆلۆژییە ئەگەرییەکانی خانەکانی hLag1. هەڵەی GPI-AP. بەڵام تاقیکردنەوەی زیاتر کە ئایا ڕێکخستنی کارایی ڕووی خانەکە لە ER بە ڕێگەی ڕیزکردن لەسەر بنەمای درێژی چەوری بەرنامە بۆ داڕێژراوە یان نا، دەبێتە بابەتی لێکۆڵینەوەکانی داهاتوومان.
جۆرەکانی ساکارۆمایسێس سێرێڤیسیا کە لەم کارەدا بەکارهێنراون لە خشتەی S1 دا هاتووە. جۆرەکانی MMY1583 و MMY1635ی SCLIM بۆ وێنەگرتنی خانە زیندووەکان لە پاشخانی W303 دروستکراون. ئەم جۆرانە کە Sec13-mCherry بە تاگی پڕۆتینی فلۆرۆسەنت دەرئەبڕن بە بەکارهێنانی ڕێگەی بنەمای کارلێکی زنجیرەیی پۆلیمیراز (PCR) لەگەڵ پلازمیدی pFA6a وەک قاڵبێک دروستکراون (23). ئەو جۆرە دەربڕینی Mid2-iRFP کە بە پڕۆتینی فلۆرۆسەنت لە ژێر کۆنترۆڵی بەرزکەرەوەی GAL1دا نیشانە کراوە بەم شێوەیە دروستکرا. گەورەکردنی PCRی زنجیرەی iRFP-KanMx لە ڤێکتەری pKTiRFP-KAN (دیاری E. O'Shea، پلازمیدی Addgene ژمارە 64687؛ http://n2t.net/addgene: 64687؛ ناسێنەری سەرچاوەی توێژینەوە (RRID): Addgene_64687) و دەخرێتە ناو C-کۆتایی Mid2ی ناوخۆیی. دوای ئەوەی زنجیرەی جینۆمی Mid2-iRFP گەورەکرا و کلۆن کرا بۆ ناو بەرزکەرەوەی GAL1، لە شوێنی Not I-Sac I ی پلازمیدی یەکگرتن pRS306 یەکخرا. پلازمیدی دەرهاویشتوو pRGS7 لەگەڵ Pst I هێڵکاری کرا بۆ ئەوەی لەگەڵ شوێنی URA3 یەکبخرێت.
جینی تێکەڵاوی Gas1-GFP لە ژێر کۆنترۆڵی بەرزکەرەوەی GAL1 لە پلازمیدی سەنترۆمێر (CEN)دا دەردەکەوێت، کە بەم شێوەیە دروست دەکرێت. زنجیرەی Gas1-GFP بە PCR لە پلازمیدی pRS416-GAS1-GFP (24) (دیاری L. Popolo) گەورەکرا و کلۆن کرا لە شوێنی Xma I–Xho I ی پلازمیدی CEN pBEVY-GL LEU2 (دیاری C). میلەر؛ پلازمیدی زیادکردن ژمارە 51225؛ http://n2t.net/addgene: 51225؛ RRID: Addgene_51225). پلازمیدە دەرهاویشتووەکە ناوی pRGS6 بوو. هەروەها جینی تێکەڵاوی Axl2-GFP لە ژێر کۆنترۆڵی بەرزکەرەوەی GAL1ی ڤێکتەری pBEVY-GL LEU2 دەردەکەوێت، و دروستکردنی بەم شێوەیەی خوارەوەیە. زنجیرەی Axl2-GFP لە پلازمیدی pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) بە PCR گەورەکرا، و کلۆن کرا لە شوێنی Bam HI-Pst I ی ڤێکتەری pBEVY-GL LEU2. پلازمیدە دەرهاویشتووەکە ناوی pRGS12 بوو. ڕێزبەندی ئۆلیگۆنۆکلیۆتایدەکانی بەکارهێنراو لەم لێکۆڵینەوەیەدا لە خشتەی S2 دا هاتووە.
جۆرەکە بە 0.2% ئەدینین و 2% گلوکۆز [YP-dextrose (YPD)]، 2% ڕافینۆز [YP-raffinose] دەوڵەمەند بە مەعجوونی دەرهاویشتەی پڕۆتینی p (YP) ناوەند (1% دەرهاویشتەی مەعجوون و 2% پڕۆتینی ept) تەواو کرا. (YPR)] یان 2% گالاکتۆز [YP-galactose (YPG)] وەک سەرچاوەیەکی کاربۆن، یان لە ناوەندێکی کەمترین دروستکراودا (0.15% بنەمای نایترۆجینی مەعجوون و 0.5% سەلفات ئەمۆنیۆم) بۆ تەواوکردنی ترشە ئەمینییە گونجاوەکان و بازنە پێویستەکان بۆ خۆراک , و 2% گلوکۆزی تێدایە (ناوەندی کەمترین گلوکۆزی دروستکراو) یان 2% گالاکتۆز (ناوەندی کەمترین گالاکتۆزی دروستکراو) وەک سەرچاوەیەکی کاربۆن.
بۆ وێنەگرتنی کاتی ڕاستەقینە، خانە گۆڕاوەکانی sec31-1 هەستیار بە پلەی گەرمی کە بیناکە لە ژێر بەرزکەرەوەی GAL1 دەرئەبڕن لە ناوەندی YPR لە پلەی گەرمی 24 پلەی سەدی بۆ ماوەی شەوێک تا قۆناغی ناوەڕاستی لۆگ گەشەیان پێدرا. دوای هێنانەکایەی لە YPG لە پلەی گەرمی 24 پلەی سەدی بۆ ماوەی 1 کاتژمێر، خانەکان لە SG لە پلەی گەرمی 37 پلەی سەدی بۆ ماوەی 30 خولەک کەرەوز کران، و پاشان گواسترانەوە بۆ پلەی گەرمی 24 پلەی سەدی بۆ ئازادکردن لە بلۆکی دەردانەکە. کۆنکاناڤالین A بەکارهات بۆ جێگیرکردنی خانەکان لەسەر سلایدێکی شووشەیی و وێنەی لەلایەن SCLIM گیرا. SCLIM تێکەڵەیەک لە مایکرۆسکۆپی فلۆرۆسەنسی پێچەوانەکراوی ئۆڵیمپوس IX-71 و عەدەسەی ڕۆنی دەرچەی ژمارەیی UPlanSApo 100×1.4 (ئۆلیمپوس)، سکانەری کۆنفۆکاڵی دیسکی سووڕاوەی خێرایی بەرز و ڕێژەی سیگناڵ بۆ ژاوەژاوی بەرز (یۆکۆگاوا ئێلیکتریکی)، سپێکترۆمێتری تایبەت، و ساردکردنەوەی تایبەتمەند چڕکەرەوەی وێنەی سیستەمەکە (هاماماتسو فۆتۆنیکس) دەتوانێت سیستەمێکی عەدەسەی گەورەکەر دابین بکات کە گەورەکردنی کۆتایی ×266.7 و کامێرای ئامێری بارگاویی کۆپڵکراو کە ئەلکترۆنەکان چەند هێندە دەکات (Hamamatsu Photonics) (21). وەرگرتنی وێنە لە ڕێگەی نەرمەکاڵا تایبەتەکان (Yokogawa Electric) ئەنجام دەدرێت. بۆ وێنە سێ ڕەهەندییەکان، ئێمە ئەکتوێتەرێکی پیزۆئێلکتریکی دروستکراوی تایبەتمان بەکارهێنا بۆ لەرزینکردنی عەدەسەی ئامانج بە شێوەیەکی ڕاست، و بەشە بیناییەکانمان کۆکردەوە بە دووری 100 نانۆمەتر لە کۆیەکدا. وێنەی Z-stack دەگۆڕدرێت بۆ داتاکانی ڤۆکسێلی سێ ڕەهەندی، و ئەرکی بڵاوبوونەوەی خاڵە تیۆریەکان کە بۆ مایکرۆسکۆپی کۆنفۆکاڵی دیسکی سووڕاوە بەکاردەهێنرێت بۆ پرۆسێسینگکردنی دیکۆلۆشن لەلایەن نەرمەکاڵای ڤۆلۆسیتی (PerkinElmer) بەکاردەهێنرێت. بە بەکارهێنانی نەرمەکاڵای ڤۆلۆسیتی بۆ ئەوەی بە شێوەیەکی ئۆتۆماتیکی ئاستێک بۆ شیکاری شوێنی هاوبەش، ERES بە بارەوە پێوانە کرا. شیکاری سکانکردنی هێڵەکان بە بەکارهێنانی نەرمەکاڵای MetaMorph (ئامێری گۆڕانکارییەکان) ئەنجامدرا.
بۆ دیاریکردنی گرنگی ئاماری نەرمەکاڵای GraphPad Prism بەکاربهێنە. بۆ تاقیکردنەوەی دوو کۆتایی Student’s t-test و تاقیکردنەوەی شیکاری یەکلایەنەی ئاسایی جیاوازی (ANOVA)، جیاوازی نێوان گروپەکان بە کاریگەرییەکی بەرچاو لەسەر P <0.05 (*) دادەنرێت.
بۆ مایکرۆسکۆپی فلۆرۆسەنسی Gas1-GFP، خانەکانی قۆناغی لۆگ بۆ ماوەی شەوێک لە YPD گەشەیان کرد و بە سەنتەرفۆج کۆکرانەوە، دوو جار بە خوێی فۆسفات بافەرکراو شۆردران، و لەسەر سەهۆڵ بۆ ماوەی لانیکەم 15 خولەک کەرەوز کران، و پاشان لە ژێر مایکرۆسکۆپدا بەردەوام بوون وەک پێشتر باسکراوە پشکنین (24). بۆ بەدەستهێنانی مایکرۆسکۆپی لایکا DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) کە بە عەدەسەی بابەتیی و فلتەری L5 (GFP) و کامێرای هاماماتسو و نەرمەکاڵای Application Suite X (LAS X) تەیار کراوە بەکارهێنراوە. .
نمونەکان بە بافەری نمونەی SDS لە پلەی گەرمی 65 پلەی سەدی بۆ ماوەی 10 خولەک، و پاشان بە ئەلکترۆفۆڕێزی جێڵی SDS-polyacrylamide (PAGE) جیاکرانەوە. بۆ شیکاری بەرگری بلۆتینگ، 10 میکرۆلیتر نمونە بۆ هەر هێڵێک بارکرا. دژەتەنی سەرەتایی: دژەتەنی پۆلیکلۆناڵی دوپشک بە شلکردنەوەیەکی 1:3000، دژە-Emp24ی پۆلیکلۆناڵی دوپشک بە شلکردنەوەیەکی 1:500، و دژە-GFPی پۆلیکلۆناڵی دوپشک (دیارییەک لە H. Riezman) بە شلکردنەوەیەکی 1:3000 بەکاربهێنە. دژەتەنی مۆنۆکلۆناڵی دژە-Pgk1ی مشک بە شلکردنەوەیەکی 1:5000 بەکارهات (دیارییەک لەلایەن J. de la Cruz). دژەتەنی لاوەکی: بەرگری گڵۆبۆلین G (IgG)ی دژە دوپشکی بزنی کۆنجۆگەیتد بە پەرۆکسیدایزی ترێ (HRP) بەکاردێت بە شلکردنەوەی 1:3000 (Pierce). IgG دژە مشکی بزنی HRP-conjugated بە شلکردنەوەیەکی 1:3000 بەکارهێنرا (Pierce). ناوچەی وەڵامدانەوەی بەرگری بە شێوازی کیمیایی درەوشاوەیی کاراکتەری SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific) بینرا.
وەک لە (31)دا باسکراوە، تاقیکردنەوەیەکی بەرگری سروشتی لەسەر بەشە دەوڵەمەندکراوەکەی ER ئەنجامدرا. بە کورتی، خانەکانی مەعجوون بە بافەری TNE [50 میلی مۆلی تریس-HCl (pH 7.5)، 150 میلی مۆلی NaCl، 5 میلی مۆلی EDTA، 1 میلی مۆلی فینێل میتیلسولفۆنیل فلۆراید و تێکەڵەی ڕێگریکەری پرۆتئاز) لە 600 نانۆمەتر (OD600) لە چڕی بینایی 100 دوو جار بشۆ. بە کۆپەڵە شووشەییەکان شکێندرا، پاشان پاشماوەی خانەکان و کۆپەڵە شووشەییەکان بە سەنتەرفۆجکردن لابران. پاشان شلەی سەرەوە لە 17,000 گم بۆ ماوەی 15 خولەک لە پلەی گەرمی 4 پلەی سەدیدا سەنتەرفۆج کرا. گوللەکە لە TNE هەڵواسرا و دیجیتالیس ساپۆنین زیادکرا بۆ چڕیی کۆتایی 1%. هەڵپەسێردراوەکە بۆ ماوەی 1 کاتژمێر لەگەڵ خولانەوەی لە پلەی گەرمی 4 پلەی سەدی کەرەوز کرا، و پاشان پێکهاتە نەتواوەکان بە سەنتەرفۆجکردن لە 13,000 گم لە پلەی گەرمی 4 پلەی سەدی بۆ ماوەی 60 خولەک لابراون. بۆ بەرگری Gas1-GFP، سەرەتا نمونەکە لەگەڵ کۆپەڵە ئاگارۆسە بەتاڵەکان (ChromoTek) لە پلەی گەرمی 4°C بۆ ماوەی 1 کاتژمێر پێشوەختە کەرەوز بکە، و پاشان لەگەڵ GFP-Trap_A (ChromoTek) لە پلەی گەرمی 4°C بۆ ماوەی 3 کاتژمێر کەرەوز بکە. کۆپەڵە بەرگری ڕەشبووەکان پێنج جار بە TNE شۆردران کە 0.2% دیگۆکسیجینینی تێدایە، بە بافەری نمونەی SDS شۆردران، لەسەر SDS-PAGE جیاکرانەوە، و بە بەرگری بلۆتینگ شیکرانەوە.
وەک لە (31)دا باسکراوە، دیاریکردنی پەیوەندی بڕبڕەیی لەسەر بەشە دەوڵەمەندکراوەکەی ER ئەنجامدرا. بە کورتی، بەشە دەوڵەمەندکراوەکەی ER لەگەڵ 0.5 میلی مۆلی دیتیۆبی (سوکسینیمیدیل پرۆپیۆنات) (پیرس، تێرمۆ فیشەر زانستی، ڕۆکفۆرد، IL، ئەمریکا؛ 20 پلەی سەدی، 20 خولەک) کەرەوز کرا. کارلێکی پەیوەندیکردن بە زیادکردنی گلیسین (50 میلی مۆلی چڕیی کۆتایی، 5 خولەک، 20 پلەی سەدی) کوژایەوە.
وەک پێشتر باسکراوە (50)، شیکاری MS بۆ سیرامید لە جۆرە کێوییەکان و جۆرەکانی GhLag1 ئەنجامدرا. بە کورتی، خانەکان گەشەیان کرد بۆ قۆناغی ڕیزبەندی (3 بۆ 4 یەکە OD600/میلی لیتر) لە YPD لە پلەی گەرمی 30 پلەی سەدی، و 25×107 خانە کۆکرانەوە. میتابۆلیزمیان بە ترشی تریکلۆرۆئەسیتیک دەکوژێتەوە. توێنەرەوەی دەرهێنان بەکاربهێنە [ئیتانۆل، ئاو، ئیتەر، پیریدین و 4.2 N ئەمۆنیۆم هایدرۆکساید (15:15:5:1:0.018 v/v)] و 1.2 نمۆڵ کوالیتی ستانداردی ناوخۆیی C17 سیرامید (860517، چەوری جەمسەری ئاڤانتی). کاراکتەری مۆنۆمیتیلامین [میتانۆل، ئاو، n-بوتانۆل و گیراوەی میتیلامین (4:3:1:5 v/v)] بەکاربهێنە بۆ ئەنجامدانی هایدرۆلیسی ئەلکالی سوکی دەرهێنراوەکە، و پاشان n-بوتانۆلی تێرکراوی ئاو بەکاربهێنە بۆ پاککردنەوەی خوێ. لە کۆتاییدا، دەرهێنراوەکە لە توێنەرێکی دۆخی ئەرێنیدا [کلۆرۆفۆرم/میتانۆل/ئاو (2:7:1) + 5 میلی مۆلی ئەسیتاتی ئەمۆنیۆم] هەڵواسرا و دەرزی لێدرا بۆ ناو سپێکترۆمێتری بارستەیی. چاودێریکردنی فرە کارلێککردن (MRM) بۆ ناسینەوە و ژماردنی مۆلیکولەکانی سپینگۆلیپید ئەنجامدرا. سپێکترۆمێتری بارستەیی چوار جەمسەری سێیەمی TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) بە سەرچاوەی ئایۆنی نانۆفلۆوی ڕۆبۆتی Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) بۆ شیکاری چەوری تەیار کراوە. وزەی پێکدادانەکە بۆ هەر پۆلێکی سیرامید باشتر کراوە. داتاکانی MS لە دۆخی ئەرێنیدا بەدەست هێنران. بۆ هەر دووبارەبوونەوەی بایۆلۆژی، سیگناڵی چەوری ناوەندی سێ پێوانە سەربەخۆیە.
وەک لە (31)دا باسکراوە، خانەکانی (800×107) کە Gas1-GFP دەردەبڕن، تووشی بەرگری سروشتی بوون. Gas1-GFP پاککراوە بە SDS-PAGE جیاکرایەوە و گواسترایەوە بۆ پەردەی پۆلیڤینیلیدین فلۆراید (PVDF). پڕۆتینەکە بە ڕەنگکردنی PVDF بە ڕەشی ئامید بینرا. باندی Gas1-GFP لە PVDF بڕدرا و 5 جار بە مێتانۆل و جارێک بە ئاوی پلەی کرۆماتۆگرافی شلە-MS (LC-MS) شۆرد. بە کەرەوزکردنی شریتی پەردە لەگەڵ 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0)، بافەر و 500μl تێکەڵەی تازە تواوەی 1 M سۆدیۆم نایترایت لە پلەی گەرمی 37°C بۆ ماوەی 3 کاتژمێر، بەشە چەورییەکە لە Gas1-GFP ئازاد دەکرێت و لایزە دەکرێت ئازادکردنی ئینۆسین فۆسفات سیرامید لە نێوان گلوکۆزامین و ئینۆسیتۆڵ (51). دوای ئەوە، شریتی پەردەکە چوار جار بە ئاوی پلەی LC-MS شۆرد، لە پلەی گەرمی ژووردا وشککرایەوە، و لە کەشوهەوای نایترۆجیندا لە پلەی گەرمی -80 پلەی سەدیدا هەڵگیرا تا شیکاری. وەک کۆنتڕۆڵێک، نمونەیەکی سپی لە پەردەی PVDF بۆ هەر تاقیکردنەوەیەک بەکارهات. پاشان چەوری دەرهێنراو لە Gas1-GFP بە MS شیکرایەوە وەک باسکراوە (50). بە کورتی، شریتەکانی PVDF کە GPI-چەوری تێدایە لە 75 میکرۆلیتر توێنەرەوەی قاڵبی نەرێنی [کلۆرۆفۆرم/میتانۆل (1:2) + 5 میلی مۆلی ئەسیتاتی ئەمۆنیۆم] هەڵواسران و ئایۆنیزەکردنی ئەلکترۆسپرای (ESI)-MRM/MS شیکاری جۆرەکانی سپینگۆلیپید (TSQ Vantage) تێپەڕاند. لەم حاڵەتەدا، داتاکانی MS لە دۆخی ئایۆنی نەرێنیدا بەدەست هات.
وەک پێشتر باسمان کرد، بەشی چەوری لەنگەری GPI لە GPI-AP ی [3H]-inositol-labeled جیاکرایەوە (16). چەوریەکان بە کرۆماتۆگرافی چینە تەنکەکان بە بەکارهێنانی سیستەمی توێنەر (55:45:10 کلۆرۆفۆرم-میتانۆل-0.25% KCl) جیاکرانەوە و بە بەکارهێنانی FLA-7000 (Fujifilm) بینران.
خانەکانی دەربڕینی Gas1-GFP (600×107) دوو جار بە بافەری TNE بە بافەری TNE شۆردران، و بە کۆپەڵە شووشەییەکان شکێنران، و پاشان سەنتەرفۆج کران بۆ لابردنی پاشماوەی خانەکان و کۆپەڵە شووشەییەکان. پاشان شلەی سەرەوە لە 17,000 گم بۆ ماوەی 1 کاتژمێر لە پلەی گەرمی 4 پلەی سەدیدا سەنتەرفۆج کرا. گوللەکە لە TNE شۆردراوە و لەگەڵ 1 U PI-PLC (Invitrogen) لە TNE کە 0.2% دیجیتالیس ساپۆنینی تێدایە بۆ ماوەی 1 کاتژمێر لە پلەی گەرمی 37 پلەی سەدیدا کەرەوز کرا. دوای چارەسەرکردنی ئەنزیم، پەردەکە بە سەنتەرفۆجکردن لە 17,000 گم لە پلەی گەرمی 4 پلەی سەدی بۆ ماوەی 1 کاتژمێر لابرا. بۆ بەرگریکردن لە Gas1-GFP، شلەی سەرەوە لەگەڵ GFP-Trap_A (ChromoTek) لە پلەی گەرمی 4°C بۆ ماوەی شەوێک کەرەوز کرا. Gas1-GFP پاککراوە کە بە SDS-PAGE جیاکراوەتەوە بە شینێکی درەوشاوەی Coomassie ڕەنگکرا. باندی ڕەنگکردنی Gas1-GFP لە خۆڵەمێشی دەوروبەری بۆری ئاوەکە بڕدرا، و پاشان دوای ئەلکیلکردن بە ئایۆدۆئەسیتامید و کەمکردنەوە بە دیتیۆترییتۆڵ، هەرسکردنی ناو جێڵ بە تریپسین ئەنجامدرا. پێپتید و پێپتیدەکانی تریپتیک بە GPI-گلایکان دەربهێنە و وشک بکەرەوە. پێپتیدی وشککراوە لە ٢٠ میکرۆلیتر ئاودا تواوەتەوە. بەشێک (8μl) بخەرە ناو LC. ستوونی ئۆکتادیسیلسیلان (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5؛ تیرەی ناوەوە 150 ملم×1.0 ملم؛ نۆمورا کیمیایی، پارێزگای ئایچی، ژاپۆن) بەکارهێنرا بۆ جیاکردنەوەی پێپتیدەکان لە ژێر بارودۆخی گرادێنتێکی تایبەتدا. قۆناغی جووڵاو بریتییە لە توێنەرەوەی A (0.08% ترشی فۆرمیک) و توێنەرەوەی B (0.15% ترشی فۆرمیک لە 80% ئەسیتۆنیتڕیل). سیستەمی Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific، Boston، Massachusetts) بەکارهات بۆ شۆردنی ستوونەکە بە توێنەرەوەی A لە ماوەی 55 خولەکدا بە ڕێژەی لێشاوی 50 میکرۆلیتر خولەک-1 بۆ ماوەی 5 خولەک، و پاشان چڕیی توێنەرەوەی B زیادکرا بۆ 40%. ، ئەمریکا). شۆردراوەکە بە بەردەوامی خرایە ناو سەرچاوەی ئایۆنی ESI، و پێپتیدەکانی تریپتیک و پێپتیدەکان لەگەڵ GPI-گلایکانەکان بە LTQ Orbitrap XL (سپێکترۆمێتری بارستەیی تەڵەی ئایۆنی هێڵی تێکەڵ-ئۆربیتراپ؛ Thermo Fisher Scientific) شیکرانەوە. لە ڕێکخستنی MS دا، ڤۆڵتیەی سەرچاوەی موولوولەیی بۆ 4.5 کیلۆڤۆڵت دانرا، و پلەی گەرمی موولوولەی گواستنەوە لە 300 پلەی سەدیدا ڕاگیرا. ڤۆڵتیەی موولوولەیی و ڤۆڵتیەی عەدەسەی بۆری بە ڕێککەوت لەسەر 15 ڤۆڵت و 50 ڤۆڵت دانرا. داتاکانی MS لە دۆخی ئایۆنی ئەرێنی (ڕوونکردنەوەی 60,000؛ وردی بارستەیی 10 بەش لە ملیۆنێکدا) لە مەودای بارستەی 300/m/z ڕێژەی بارستە/بارگاوی (m/z) 3000 بەدەست هات (CID)].
ھاوشێوەکردنی MD بە بەکارهێنانی نەرمەکاڵای GROMACS (52) و کێڵگەی هێزی MARTINI 2 (53-55) ئەنجامدرا. پاشان دروستکەری پەردەی CHARMM GUI (56، 57) بەکارهێنرا بۆ دروستکردنی دوو چینێک کە دیۆلیۆیلفۆسفاتیدیلکۆلین (DOPC) و Cer C18 یان DOPC و Cer C26ی تێدایە. تۆپۆلۆژی و کۆئۆردینیاتی Cer C26 لە DXCE وەرگیراوە بە لابردنی کۆپەڵە زیادەکان لە کلکی سپینگۆسین. ئەو پرۆسەیەی لە خوارەوە باسکراوە بەکاربهێنە بۆ هاوسەنگکردنی چینە دووانە و بەڕێوەبردنی، پاشان دوا کۆئۆردینیاتی سیستەمەکە بەکاربهێنە بۆ دروستکردنی سیستەمێک کە Emp24ی تێدایە. دۆمەینی ترانزەمێمبرینی مەعجوون Emp24 (پاشماوەکانی 173 تا 193) وەک α-هێلیکس بە بەکارهێنانی پێکهاتەی گەردیلەیی ئامرازی بینراوی MD (VMD) دروستکرا (58). پاشان، دوای لابردنی چەورییە سەریەککەوتووەکان، پڕۆتینەکە بە شێوەیەکی درشت دانەوێڵەیی کرا و بە بەکارهێنانی CHARMM GUI خرایە ناو دوو چینەکەوە. سیستەمی کۆتایی 1202 DOPC و 302 Cer C26 یان 1197 DOPC و 295 Cer C18 و Emp24 لەخۆدەگرێت. ئایۆنیزکردنی سیستەمەکە بۆ چڕیی 0.150M. چوار دووبارەکردنەوەی سەربەخۆ بۆ دوو پێکهاتەی دوو چین دروستکرا.
دوو چینە چەورییەکە بە بەکارهێنانی پرۆسەی CHARMM GUI هاوسەنگ دەکرێت، کە بریتییە لە کەمکردنەوە و پاشان هاوسەنگکردنی 405,000 هەنگاو، کە تێیدا سنووردارکردنی شوێنەکان وردە وردە کەم دەکرێنەوە و نەهێڵرێن، و هەنگاوی کات لە 0.005 ps بۆ 0.02 ps زیاد دەکرێت. دوای هاوسەنگکردن، 6 میکرۆ چرکە بەرهەم دەهێنێت لەگەڵ هەنگاوی کاتیی 0.02 ps. دوای دانانی Emp24، هەمان پرۆسەی CHARMM GUI بەکاربهێنە بۆ کەمکردنەوە و هاوسەنگی سیستەمەکە، و پاشان بۆ ماوەی 8 چرکە لە بەرهەمهێناندا کاربکە.
بۆ هەموو سیستەمەکان، لە کاتی پرۆسەی هاوسەنگکردندا، پەستانەکە لەلایەن بارۆستاتی بێرێندسن (59) کۆنتڕۆڵ دەکرێت، و لە کاتی پرۆسەی بەرهەمهێناندا، پەستانەکە لەلایەن بارۆستاتی پارینیلۆ-ڕەحمانەوە کۆنتڕۆڵ دەکرێت (60). لە هەموو حاڵەتەکاندا، تێکڕای پەستان 1 بارە و پلانی کۆپڵکردنی پەستانی نیمچە هاوشێوە بەکاردەهێنرێت. لە پرۆسەی هاوسەنگی و بەرهەمهێناندا، گەرمکەرەوەیەک (61) لەگەڵ قەبارەدانانی خێرایی بەکاردەهێنرێت بۆ جووتکردنی پلەی گەرمی گەردیلەکانی پڕۆتین، چەوری و توێنەر بە ڕێککەوت. لە ماوەی تەواوی ئۆپەراسیۆنەکەدا پلەی گەرمی ئامانج 310K یە. کارلێکی نابەستنەوە بە دروستکردنی لیستی جووتبوون بە بەکارهێنانی پلانی ڤێرلێت بە 0.005 لێبوردەیی بافەر حیسابی بۆ دەکرێت. زاراوەی کولۆمب بە بەکارهێنانی کێڵگەی کارلێک و مەودای بڕینی 1.1 نانۆمەتر حیسابی بۆ دەکرێت. زاراوەی ڤاندەر واڵس پلانی بڕین بەکاردەهێنێت کە مەودای بڕینی 1.1 نانۆمەترە، و پلانی بڕینی ڤێرلێت بۆ وەرچەرخانی پۆتانسێل بەکاردێت (62).
بە بەکارهێنانی VMD، درێژی شەپۆلی بڕین لە نێوان کۆپەڵە فۆسفاتەکانی DOPC یان کۆپەڵە سیرامید AM1 و پڕۆتینەکە 0.7 نانۆمەترە، و ژمارەی ئەو چەوریانەی کە کارلێک لەگەڵ پڕۆتینەکەدا دەکەن حیسابی بۆ دەکرێت. بەپێی ئەم فۆرمولەیەی خوارەوە، فاکتەری کەمبوونەوە-دەوڵەمەندکردن (DE) وەک لە (63)دا حیسابی بکە: فاکتەری DE = (بڕی کۆی چەورییەکانی ناو پڕۆتینەکە 0.7) لە پڕۆتینی 0.7 (بڕی Cer لە کۆی چەورییەکاندا)
بەهای ڕاپۆرتکراو وەک تێکڕا بەدەست دێت، و هێڵەکانی هەڵە چوار کۆپی سەربەخۆی SEن. گرنگی ئاماری فاکتەری DE بە تاقیکردنەوەی t [(مامناوەندیDE-factor-1)/SE] حیسابی بۆ دەکرێت. بەهای P لە دابەشکردنی یەک کلکەوە حیسابی بکە.
ئامرازی GROMACS بەکارهات بۆ حیسابی نەخشەی چڕی لایەنی دوو ڕوویی ئەو سیستەمەی کە Emp24ی تێدایە لە ماوەی 250 ns کۆتایی شوێنپێکەدا. بۆ بەدەستهێنانی نەخشەی دەوڵەمەندکردن/کەمبوونەوەی سیرامید، نەخشەی چڕی Cer دابەش دەکرێت بەسەر کۆی نەخشەی Cer و DOPC، و پاشان دابەش دەکرێت بەسەر چڕیی Cer لە جەستەدا. هەمان پێوەرەکانی نەخشەی ڕەنگەکان بەکاردەهێنرێت.
بۆ زانیاری تەواوکەر بۆ ئەم بابەتە، تکایە سەیری http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 بکەن
ئەمە بابەتێکی دەستڕاگەیشتنێکی کراوەیە کە بەپێی مەرجەکانی مۆڵەتی ئیسباتکردنی کرێتیڤ کۆمۆن-نابازرگانی دابەشکراوە، کە ڕێگە بە بەکارهێنان و دابەشکردن و دووبارە بەرهەمهێنانەوە دەدات لە هەر میدیایەکدا، بە مەرجێک بەکارهێنانی کۆتایی بۆ قازانجی بازرگانی نەبێت و پێشمەرجەکە ئەوەیە کە کارە ڕەسەنەکە ڕاست بێت. سەرچاوە.
تێبینی: تەنها داوات لێدەکەین ناونیشانی ئیمەیڵەکەت بدەیت بۆ ئەوەی ئەو کەسەی پێشنیاری دەکەیت بۆ پەیجەکە بزانێت کە تۆ دەتەوێت ئیمەیڵەکە ببینێت و سپام نییە. ئێمە هیچ ناونیشانێکی ئیمەیڵ ناگرین.
ئەم پرسیارە بەکاردێت بۆ تاقیکردنەوەی ئەوەی کە ئایا تۆ سەردانکەریت و ڕێگریکردن لە ناردنی سپام بە شێوەیەکی ئۆتۆماتیکی.
سۆفیا ڕۆدریگێز-گالاردۆ، کازۆ کورۆکاوا، سوزانا سابیدۆ-بۆزۆ، ئەلیخاندرۆ کۆرتێز · گۆمێز (ئەلیخاندرۆ کۆرتیس-گۆمێز)، ئاتسوکۆ ئیکێدا (ئاتسوکۆ ئیکێدا)، ڤالێریای زۆنی (ڤالێریا زۆنی)، ئۆکسیلیدۆرا ئەگویلێرا-ڕۆمێرۆ، ئانا ماریا پێرێز -لینێرۆ، سێرجیۆ لۆپێز (سێرجیۆ لۆپێز)، میهۆ واگا (میهۆ واگا)، میساکۆ ئارمان (میساکۆ ئارمان)، میاکۆ ڕیمان (میاکۆ ڕیمان)، پرۆ ئاکیرا، ستیفانۆ فانی، ئاکیهیکۆ ناکانۆ، مانوێل مونیز
وێنەگرتنی سێ ڕەهەندی ڕوونی بەرز لە کاتی ڕاستەقینەدا گرنگی درێژی زنجیرەی سیرامید بۆ ڕیزکردنی پڕۆتین لە شوێنە هەڵبژێردراوەکانی دەرچوون ئاشکرا دەکات.
سۆفیا ڕۆدریگێز-گالاردۆ، کازۆ کورۆکاوا، سوزانا سابیدۆ-بۆزۆ، ئەلیخاندرۆ کۆرتێز · گۆمێز (ئەلیخاندرۆ کۆرتیس-گۆمێز)، ئاتسوکۆ ئیکێدا (ئاتسوکۆ ئیکێدا)، ڤالێریای زۆنی (ڤالێریا زۆنی)، ئۆکسیلیدۆرا ئەگویلێرا-ڕۆمێرۆ، ئانا ماریا پێرێز -لینێرۆ، سێرجیۆ لۆپێز (سێرجیۆ لۆپێز)، میهۆ واگا (میهۆ واگا)، میساکۆ ئارمان (میساکۆ ئارمان)، میاکۆ ڕیمان (میاکۆ ڕیمان)، پرۆ ئاکیرا، ستیفانۆ فانی، ئاکیهیکۆ ناکانۆ، مانوێل مونیز
وێنەگرتنی سێ ڕەهەندی ڕوونی بەرز لە کاتی ڕاستەقینەدا گرنگی درێژی زنجیرەی سیرامید بۆ ڕیزکردنی پڕۆتین لە شوێنە هەڵبژێردراوەکانی دەرچوون ئاشکرا دەکات.
©2020 کۆمەڵەی ئەمریکی بۆ پێشخستنی زانست. هەموو مافەکان پارێزراوە. AAAS هاوبەشی کۆمپانیاکانی HINARI، AGORA، OARE، CHORUS، CLOCKSS، CrossRef و COUNTER ە. زانستی پێشکەوتن ISSN 2375-2548.