بابەتەکە بەشێکە لە تەوەری توێژینەوەکە “باشترکردنی بەرگری گەنمەشامی بەرامبەر بە ماددە نەخۆشخوازەکان و زیانبەخشەکان”، سەیری هەر ٥ بابەتەکە بکەن
هۆکاری نەکرۆزی نەخۆشی ڕووەکی قارچکی Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary ستراتیژییەکی فرە قات بەکاردەهێنێت بۆ تووشکردنی ڕووەکی خانەخوێی جیاواز. ئەم توێژینەوەیە پێشنیاری بەکارهێنانی دیامین L-ornithine دەکات، کە ترشە ئەمینییە ناپرۆتینییە و هاندەری دروستکردنی ترشە ئەمینییە بنەڕەتییەکانی دیکەیە، وەک ستراتیژییەکی بەڕێوەبردنی بەدیل بۆ بەرزکردنەوەی وەڵامە گەردیلەیی و فیزیۆلۆژی و بایۆکیمیاییەکانی Phaseolus vulgaris L. بۆ قاڵبی سپی کە بەهۆی Pseudomonas sclerotiorum ەوە دروست دەبێت. تاقیکردنەوەکانی ناو ئامێری پشکنینی دەریانخست کە L-ornithine بە شێوەیەکی بەرچاو گەشەی میسیلی S. pyrenoidosa بە شێوەیەکی وابەستە بە ژەمە دەرمانەکە ڕێگری دەکات. جگە لەوەش دەتوانێت بە شێوەیەکی بەرچاو توندی قاڵبی سپی لە ژێر بارودۆخی گەرمخانەدا کەم بکاتەوە. جگە لەوەش، L-ornithine گەشەی ڕووەکە چارەسەرکراوەکانی هان دا، ئەمەش ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە چڕییەکانی L-ornithine تاقیکراوی ژەهراویکردنی ڕووەکی نەبوون بۆ ڕووەکە چارەسەرکراوەکان. سەرەڕای ئەوە، L-ornithine دەربڕینی دژە ئۆکسێنەرە نائەنزیمییەکان (کۆی گشتی فینۆلیک و فلاڤۆنۆیدەکانی تواوە) و دژە ئۆکسێنەرە ئەنزیمییەکان (کاتالاز (CAT)، پەرۆکسیدایز (POX)، و پۆلیفینۆڵ ئۆکسیدایز (PPO)) بەرزکردەوە، و دەربڕینی سێ جینی پەیوەست بە دژە ئۆکسێنەر (PvCAT1، PvSOD، و PvGR) زیادکرد. سەرەڕای ئەوە، شیکاری لە سیلیکۆدا بوونی پڕۆتینێکی گوماناوی ئۆکسالۆسیتات ئەسیتیلهایدرۆلاز (SsOAH) لە جینۆمی S. sclerotiorum دەرکەوت، کە زۆر هاوشێوەی پڕۆتینەکانی ئۆکسالۆسیتات ئەسیتیلهایدرۆلاز (SsOAH) بوو لە Aspergillus fijiensis (AfOAH) و Penicillium sp. (PLOAH) لە ڕووی شیکاری کارایی، دۆمەینە پارێزراوەکان، و تۆپۆلۆژی. ئەوەی جێگای سەرنجە، زیادکردنی L-ornithine بۆ ناوەندی شۆربای دیکسترۆزی پەتاتە (PDB) دەربڕینی جینی SsOAH لە S. sclerotiorum mycelia بە شێوەیەکی بەرچاو کەمکردەوە. بە هەمان شێوە، بەکارهێنانی دەرەکی L-ornithine دەربڕینی جینی SsOAH لە مایسلیای قارچکیدا کە لە ڕووەکە چارەسەرکراوەکانەوە کۆکراونەتەوە بە شێوەیەکی بەرچاو کەمکردەوە. لە کۆتاییدا، بەکارهێنانی L-ornithine بە شێوەیەکی بەرچاو دەردانی ترشی ئۆکسالیکی لە هەردوو ناوەندەکەی PDB و گەڵا تووشبووەکاندا کەمکردەوە. لە کۆتاییدا، L-ornithine ڕۆڵێکی سەرەکی دەگێڕێت لە پاراستنی دۆخی ڕیدۆکس و هەروەها بەرزکردنەوەی وەڵامی بەرگری ڕووەکە تووشبووەکان. ئەنجامی ئەم توێژینەوەیە ڕەنگە یارمەتیدەر بێت لە پەرەپێدانی ڕێگەی داهێنەرانە و دۆستی ژینگە بۆ کۆنترۆڵکردنی قاڵبی سپی و کەمکردنەوەی کاریگەرییەکانی لەسەر بەرهەمهێنانی فاسۆلیا و بەرهەمەکانی تر.
قاڵبی سپی، کە بەهۆی قارچکی نەکرۆتڕۆفیکی Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary دروست دەبێت، نەخۆشییەکی وێرانکەر و کەمکردنەوەی بەرهەمە کە مەترسییەکی جددی لەسەر بەرهەمهێنانی فاسۆلیا جیهانی (Phaseolus vulgaris L.) دروست دەکات (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum یەکێکە لە قورسترین ماددە نەخۆشخوازەکانی ڕووەکی قارچکی کە لە خاکدا دەگوازرێتەوە بۆ کۆنترۆڵکردن، لەگەڵ مەودای خانەخوێیەکی فراوان کە زیاتر لە 600 جۆری ڕووەکی تێدایە و توانای خێراکردنی شانەکانی خانەخوێ بە شێوەیەکی نادیاریکراو (Liang and Rollins, 2018). لە ژێر بارودۆخێکی نالەباردا، قۆناغێکی گرنگ لە سوڕی ژیانیدا تێدەپەڕێت، بۆ ماوەیەکی زۆر وەک پێکهاتەی ڕەش، ڕەق، هاوشێوەی تۆو کە پێی دەوترێت 'سکلێرۆتیا' لە خاکدا یان وەک گەشەکردنی سپی و پڕ لە پەڵە لە میسیلیۆم یان چەقۆی ڕووەکی تووشبوودا بە خەوتوو دەمێنێتەوە (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum توانای دروستکردنی سکلێرۆتیای هەیە، ئەمەش ڕێگەی پێدەدات لە کێڵگە تووشبووەکاندا بۆ ماوەیەکی زۆر بژی و لە کاتی نەخۆشیدا بەردەوام بێت (Schwartz et al., 2005). سکلێرۆتیای دەوڵەمەندە بە ماددە خۆراکیەکان، دەتوانێت بۆ ماوەیەکی زۆر لە خاکدا بەردەوام بێت، و وەک کوتانی سەرەکی بۆ هەوکردنەکانی دواتر کاردەکات (Schwartz et al., 2005). لە ژێر بارودۆخی لەباردا، سکلێرۆتیا دەڕوێن و سپۆرەکانی هەوا بەرهەم دەهێنن کە دەتوانن هەموو بەشەکانی سەرەوەی زەوی ڕووەکەکە تووش بکەن، لەوانەش بەڵام سنووردار نەکراوە بە گوڵ، لق، یان پۆد (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum ستراتیژییەکی فرە قات بەکاردەهێنێت بۆ تووشکردنی ڕووەکە خانەخوێکانی، کە زنجیرەیەک ڕووداوی هەماهەنگ لە ڕواندنی سکلێرۆتیاوە تا گەشەکردنی نیشانەکان لەخۆدەگرێت. لە سەرەتادا، S. sclerotiorum سپۆرە هەڵواسراوەکان (پێیان دەوترێت ئەسکۆسپۆرەکان) لە پێکهاتە هاوشێوەکانی قارچکەوە کە پێیان دەوترێت apothecia بەرهەم دەهێنێت، کە دەبنە هەوا و گەشە دەکەن بۆ سکلێرۆتیای ناجووڵاو لەسەر پاشماوەی ڕووەکی تووشبوو (Bolton et al., 2006). پاشان قارچکەکە ترشی ئۆکسالیک دەردەدات، کە هۆکارێکی ڤایرۆسییە، بۆ کۆنترۆڵکردنی pH دیواری خانەکانی ڕووەک، پەرەپێدانی تێکچوونی ئەنزیمیی و داگیرکردنی شانەکان (Hegedus and Rimmer, 2005)، و سەرکوتکردنی تەقینەوەی ئۆکسجینی ڕووەکی خانەخوێ. ئەم پرۆسەی ترشکردنە دیواری خانەکانی ڕووەک لاواز دەکات، ژینگەیەکی لەبار بۆ کارکردنی ئاسایی و کارامەی ئەنزیمەکانی تێکدەری دیواری خانەکانی قارچکی (CWDEs) دابین دەکات، ڕێگە بە ماددە نەخۆشخوازەکە دەدات کە بەربەستی فیزیکی زاڵ بێت و بچێتە ناو شانەکانی خانەخوێ (Marciano et al., 1983). کاتێک کە دەچێتە ناوەوە، S. sclerotiorum ژمارەیەک CWDE دەردەدات، وەک پۆلیگالاکتورۆناز و سێلولاز، کە بڵاوبوونەوەی لە شانە تووشبووەکاندا ئاسان دەکات و دەبێتە هۆی نەکرۆزی شانەکان. پێشکەوتنی برینەکان و ماتەی هایفال دەبێتە هۆی نیشانە تایبەتەکانی قاڵبی سپی (Hegedus and Rimmer, 2005). لە هەمان کاتدا، ڕووەکە خانەخوێیەکان نەخشە گەردیلەیەکانی پەیوەست بە ماددە نەخۆشخوازەکان (PAMPs) لە ڕێگەی وەرگرەکانی ناسینەوەی نەخشەکانەوە (PRRs) دەناسنەوە، کە زنجیرەیەک ڕووداوی ئاماژەدان دەستپێدەکات کە لە کۆتاییدا وەڵامەکانی بەرگری چالاک دەکەن.
سەرەڕای دەیان ساڵە هەوڵەکانی کۆنترۆڵکردنی نەخۆشی، کەمیی جێرمۆپلازمای بەرگری گونجاو لە فاسۆلیادا دەمێنێتەوە، وەک لە بەرهەمە بازرگانییەکانی تردا، بەهۆی بەرگری و مانەوە و گونجاندنی ماددە نەخۆشخوازەکە. بۆیە بەڕێوەبردنی نەخۆشیەکان زۆر چالاکە و پێویستی بە ستراتیژییەکی یەکگرتوو و فرەلایەنە هەیە کە تێکەڵەیەک لە پراکتیزە کولتوورییەکان، کۆنترۆڵکردنی بایۆلۆژی و قارچککوژە کیمیاییەکان لەخۆدەگرێت (O'Sullivan et al., 2021). کۆنتڕۆڵکردنی کیمیایی قاڵبی سپی کاریگەرترینە چونکە قارچککوژەکان کاتێک بە شێوەیەکی دروست و لە کاتی گونجاودا بەکاردەهێنرێن دەتوانن بە شێوەیەکی کاریگەر کۆنترۆڵی بڵاوبوونەوەی نەخۆشییەکە بکەن و توندی هەوکردن کەمبکەنەوە و کەمترین لەدەستدانی بەرهەم. بەڵام، زیادەڕۆیی لە بەکارهێنان و زۆر پشتبەستن بە قارچککوژەکان دەتوانێت ببێتە هۆی سەرهەڵدانی جۆرە بەرگریکارەکانی S. sclerotiorum و کاریگەری نەرێنی لەسەر زیندەوەرە نائامانجەکان، تەندروستی خاک، و کوالیتی ئاو هەبێت (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). بۆیە دۆزینەوەی بەدیلەکانی ژینگەدۆستانە بووەتە یەکەمایەتی سەرەکی.
پۆلیامینەکان (PAs)، وەکو پوترێسین، سپێرمیدین، سپێرمین، و کاداڤێرین، دەتوانن وەک بەدیلێکی بەڵێندەر لە دژی ماددە نەخۆشخوازەکانی ڕووەکی هەڵگیراو لە خاکدا کاربکەن، بەمەش بەکارهێنانی قارچککوژە کیمیاییە مەترسیدارەکان بە تەواوی یان بەشێکیان کەمدەکاتەوە (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). لە ڕووەکە باڵاکاندا، PAs بەشدارن لە زۆرێک لە پرۆسەی فیزیۆلۆژیدا لەوانە، بەڵام سنووردار نەکراوە بە، دابەشبوونی خانەکان، جیاکردنەوە، و وەڵامدانەوەی فشارە نازیندەیی و بایۆتیکییەکان (Killiny and Nehela, 2020). دەتوانن وەک دژە ئۆکسێنەر کاربکەن، یارمەتی پاککردنەوەی جۆرەکانی ئۆکسجینی کارلێککەر بدەن (ROS)، پاراستنی هێمۆستاسیس ڕیدۆکس (Nehela and Killiny, 2023)، جینەکانی پەیوەست بە بەرگری هان بدەن (Romero et al., 2018)، ڕێڕەوی گۆڕانکاری گۆڕانکاری جۆراوجۆر ڕێکبخەن (Nehela and Killiny, 2023)، گۆڕینی فیتۆهۆرمۆنی ناوخۆیی (Nehela and Killiny, 2023) 2019)، بەرگری بەدەست هاتووی سیستماتیکی (SAR) دادەمەزرێنن، و کارلێکەکانی ڕووەک-نەخۆشکەر ڕێکدەخەن (Nehela and Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). شایەنی باسە کە میکانیزم و ڕۆڵی تایبەتی PAs لە بەرگری ڕووەکەکاندا بەپێی جۆرەکانی ڕووەک، ماددە نەخۆشخوازەکان و بارودۆخی ژینگەیی دەگۆڕێت. زۆرترین PA لە ڕووەکەکاندا لە پۆلیئەمین L-ornithine ی بنەڕەتییەوە بایۆسێنتێز دەکرێت (Killiny and Nehela, 2020).
L-ornithine چەندین ڕۆڵی هەیە لە گەشەکردن و گەشەکردنی ڕووەکەکاندا. بۆ نموونە، لێکۆڵینەوەکانی پێشوو دەریانخستووە کە لە برنجدا (Oryza sativa)، ئۆرنیتین لەوانەیە پەیوەندی بە دووبارە بەکارهێنانەوەی نایترۆجینەوە هەبێت (Liu et al., 2018)، بەرهەمی برنج، کوالیتی و بۆن (Lu et al., 2020)، و وەڵامدانەوەی فشاری ئاو (Yang et al., 2000). جگە لەوەش، بەکارهێنانی دەرەکی L-ornithine بەرگەگرتنی وشکەساڵی لە چەوەندەر (Beta vulgaris) بە شێوەیەکی بەرچاو بەرزکردەوە (Hussein et al., 2019) و فشاری خوێی لە پیاز (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu و Çavuşoǧlu, 2021) و کاجو (Anacardium occiden) کەمکردەوە ڕووەکەکان (da Rocha et al., 2012). ڕۆڵی ئەگەری L-ornithine لە بەرگریکردن لە فشاری ناژیاویدا ڕەنگە بەهۆی بەشداریکردنی بێت لە کەڵەکەبوونی پرۆلین لە ڕووەکە چارەسەرکراوەکاندا. بۆ نموونە، جینەکانی پەیوەست بە میتابۆلیزمی پرۆلین، وەک جینەکانی ئۆرنیتین دێڵتا ئەمینۆترانسفێراس (دێلتا-OAT) و پرۆلین دیهایدرۆجیناز (ProDH1 و ProDH2)، پێشتر ڕاپۆرت کراون کە بەشدارن لە بەرگریکردن لە نیکۆتیانا بنتامیانا و ئارابیدۆپسیس تالیانا لە دژی جۆرەکانی سیرینگای سۆدۆمۆناس کە خانەخوێ نین (سێنتیل-کومار و... میسۆر، ٢٠١٢). لە لایەکی دیکەوە، قارچکی ئۆرنیتین دیکاربۆکسیلاز (ODC) پێویستە بۆ گەشەی ماددە نەخۆشخوازەکان (Singh et al., 2020). ئامانجکردنی ODC ی Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici لە ڕێگەی بێدەنگکردنی جینی هاندەری خانەخوێ (HIGS) بەرگری ڕووەکی تەماتەی بەرامبەر بە پژمینی فوساریۆم بە شێوەیەکی بەرچاو بەرزکردەوە (Singh et al., 2020). بەڵام ڕۆڵی پۆتانسێلی بەکارهێنانی ئۆرنیتینی دەرەکی لە دژی فشارە بایۆتیکییەکان وەکو فیتۆپاتۆجینەکان بە باشی لێکۆڵینەوەی لەسەر نەکراوە. لەوەش گرنگتر، کاریگەرییەکانی ئۆرنیتین لەسەر بەرگری نەخۆشی و دیاردە بایۆکیمیایی و فیزیۆلۆژییەکانی پەیوەست بەوەوە تاڕادەیەکی زۆر نەدۆزراونەتەوە.
تێگەیشتن لە ئاڵۆزی تووشبوون بە S. sclerotiorum لە گەنمەشامی گرنگە بۆ پەرەپێدانی ستراتیژییەکانی کۆنترۆڵکردنی کاریگەر. لەم لێکۆڵینەوەیەدا، ئامانجمان دەستنیشانکردنی ڕۆڵی پۆتانسێلی دیامین L-ornithine وەک هۆکارێکی سەرەکی لە بەرزکردنەوەی میکانیزمەکانی بەرگری و بەرگری ڕووەکی پەلەوەری بەرامبەر بە تووشبوون بە Sclerotinia sclerotiorum. ئێمە گریمانە دەکەین کە، جگە لە بەرزکردنەوەی وەڵامەکانی بەرگری ڕووەکە تووشبووەکان، L-ornithine ڕۆڵێکی سەرەکی دەگێڕێت لە پاراستنی دۆخی ڕیدۆکس. ئێمە پێشنیار دەکەین کە کاریگەرییە ئەگەرییەکانی L-ornithine پەیوەندییان بە ڕێکخستنی میکانیزمەکانی بەرگری دژە ئۆکسێنەرە ئەنزیمییەکان و نائەنزیمییەکان و دەستوەردان لە هۆکارەکانی نەخۆشخواز/ڤایرۆلینسی قارچک و پڕۆتینەکانی پەیوەندیدارەوە هەیە. ئەم کاراییە دووانەیەی L-ornithine دەیکاتە کاندیدێکی بەڵێندەر بۆ ستراتیژییەکی بەردەوام بۆ کەمکردنەوەی کاریگەرییەکانی قاڵبی سپی و بەرزکردنەوەی بەرگری بەرهەمە باوەکانی گەنمەشامی بەرامبەر بەم ماددە نەخۆشخوازە قارچکە بەهێزە. ئەنجامی ئەم توێژینەوەیە ڕەنگە یارمەتیدەر بێت لە پەرەپێدانی ڕێگەی داهێنەرانە و دۆستی ژینگە بۆ کۆنترۆڵکردنی قاڵبی سپی و کەمکردنەوەی کاریگەرییەکانی لەسەر بەرهەمهێنانی گەنمەشامی.
لەم لێکۆڵینەوەیەدا، جۆرێکی بازرگانی ئامادەیی فاسۆلیا باو، جیزا ٣ (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3)، وەک مادەی تاقیکاری بەکارهێنرا. تۆوی تەندروست بە میهرەبانی لەلایەن بەشی توێژینەوەی پەلەوەری، پەیمانگای توێژینەوەی بەرهەمی مەیدانی (FCRI)، سەنتەری توێژینەوەی کشتوکاڵی (ARC)، میسر دابینکرا. پێنج تۆو لەناو دەفری پلاستیکیدا چێنران (تیرەی ناوەوە 35 سم، قووڵی 50 سم) پڕکرابوون لە خاکی تووشبوو بە S. sclerotiorum لە ژێر بارودۆخی گەرمخانەییدا (25 ± 2 پلەی سەدی، شێی ڕێژەیی 75 ± 1%، 8 سەعات ڕووناکی/16 سەعات تاریک). لە 7-10 ڕۆژ دوای چاندن (DPS)، نەمامەکان تەنک کرانەوە بۆ ئەوەی تەنها دوو نەمام بە گەشەکردنی یەکسان و سێ گەڵای تەواو فراوان لە هەر گۆزەیەکدا بەجێبهێڵن. هەموو ڕووەکەکانی گۆزەیی لە دوو هەفتە جارێکدا ئاویان پێدەدرا و مانگانە بە ڕێژەی پێشنیارکراوی جۆری پێدراو پیتێندرا.
بۆ ئامادەکردنی چڕیی 500 میلیگرام/لیتر لە L-ornithinediamine (هەروەها بە ترشی (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic ناسراوە؛ Sigma-Aldrich، Darmstadt، Germany)، سەرەتا 50 میلیگرام لە 100 مل ئاوی تەعقیمکراوی تەعقیمکراودا تواوەتەوە. پاشان گیراوەی ستۆکەکە شلکرایەوە و لە تاقیکردنەوەکانی دواتردا بەکارهات. بە کورتی، شەش زنجیرەی چڕییەکانی L-ornithine (12.5، 25، 50، 75، 100، و 125 mg/L) لە ناو ئامێری پشکنیندا تاقیکرانەوە. جگە لەوەش ئاوی تەعقیمکراوی تەعقیمکراو وەک کۆنتڕۆڵی نەرێنی (Mock) بەکارهێنرا و قارچککوژی بازرگانی “Rizolex-T” 50% تۆزی تەڕکراو (toclofos-methyl 20% + thiram 30%؛ KZ-Kafr El Zaayat کۆمپانیای قڕکەر و ماددە کیمیاییەکان، کفر ئەل زایات، پارێزگای غەربیا، میسر) وەک کۆنتڕۆڵی ئەرێنی بەکارهێنرا. قارچککوژی بازرگانی "Rizolex-T" لە ناو ئامێری پشکنیندا تاقیکرایەوە بە پێنج چڕیی (2، 4، 6، 8 و 10 میلیگرام/لیتر).
نمونەی لقە و پۆدەکانی باوی فاسۆلیا کە نیشانە تایبەتەکانی قاڵبی سپی نیشان دەدەن (رێژەی تووشبوون: 10-30%) لە کێڵگە بازرگانییەکان کۆکرانەوە. هەرچەندە زۆربەی ماددە ڕووەکییە تووشبووەکان بە جۆرە/جۆرەکان دەستنیشان کران (جۆری بازرگانی ئامادە جیزا ٣)، بەڵام هەندێکی تر، بە تایبەت ئەوانەی لە بازاڕە ناوخۆییەکانەوە بەدەست هاتوون، لە جۆرە نەناسراوەکان بوون. ماددە تووشبووە کۆکراوەکان سەرەتا بە گیراوەی 0.5% سۆدیۆم هایپۆکلۆرایت بۆ ماوەی 3 خولەک بە ڕووکار تەعقیم کران، پاشان چەند جارێک بە ئاوی تەعقیمکراوی تەعقیمکراو شۆردران و بە کاغەزی فلتەری تەعقیمکراو وشککرانەوە بۆ لابردنی ئاوی زیادە. پاشان ئەندامە تووشبووەکان لە شانەکانی ناوەڕاستەوە پارچە پارچە کران (لە نێوان شانە تەندروست و تووشبووەکان)، لەسەر ناوەندێکی پەتاتە دیکسترۆزی ئاگار (PDA) کشتوکاڵ کران و لە پلەی گەرمی 25 ± 2 پلەی سەدی لەگەڵ خولی ڕووناکی 12 سەعات/12 سەعاتی تاریکی بۆ ماوەی 5 ڕۆژ کەرەوز کران بۆ هاندانی دروستبوونی سکلێرۆتیا. هەروەها شێوازی نوکی میسیلیال بەکارهات بۆ پاککردنەوەی جیاکراوەکانی قارچک لە کولتوورە تێکەڵەکان یان پیسبووەکان. جیاکراوەی قارچکی پاککراوە سەرەتا بە پشتبەستن بە تایبەتمەندییە مۆرفۆلۆژییە کولتوورییەکانی دەستنیشانکرا و پاشان پشتڕاستکرایەوە کە S. sclerotiorum ە بە پشتبەستن بە تایبەتمەندییە وردبینییەکان. لە کۆتاییدا، هەموو جیاکراوە پاککراوەکان تاقیکرانەوە بۆ نەخۆشی دروستکردن لەسەر جۆری فاسۆلیای باوی ئامادەیی جیزا ٣ بۆ ئەوەی لەگەڵ گریمانەکانی کۆچدا بگونجێت.
سەرەڕای ئەوە، داگیرکەرترین جیاکراوەی S. sclerotiorum (جیاکراوی #3) زیاتر پشتڕاستکرایەوە لەسەر بنەمای ڕێکخستنی فەواصلی نووسراوی ناوەوە (ITS) وەک لەلایەن White et al., 1990 باسکراوە؛ Baturo-Ciesniewska et al., 2017. بە کورتی، جیاکراوەکان لە شۆربای دیکسترۆزی پەتاتە (PDB)دا کشتوکاڵ کران و لە پلەی گەرمی 25 ± 2 °C بۆ ماوەی 5-7 ڕۆژ کەرەوز کران. پاشان مایسلیۆمی قارچکی کۆکرایەوە، لە ڕێگەی قوماشی پەنیرەوە پاڵاوت، دوو جار بە ئاوی تەعقیمکراو شۆرد و بە کاغەزی فلتەری تەعقیمکراو وشککرایەوە. DNA جینۆمی بە بەکارهێنانی کیتی مینی ئامادەکردنی قارچکی/بەکتریای Quick-DNATM جیاکرایەوە (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). پاشان ناوچەی rDNA ی ITS بە بەکارهێنانی جووتە پرایمەرە تایبەتەکە ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC؛ قەبارەی چاوەڕوانکراو: 540 bp) گەورەکرا (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). بەرهەمە پاککراوەکانی PCR پێشکەش کران بۆ ڕێکخستن (Beijing Aoke Dingheng Biotechnology Co., Ltd.). زنجیرەکانی ITS rDNA بە دوو ئاراستە بە بەکارهێنانی ڕێگەی ڕێکخستنی سەنگەر ڕێکخران. پاشان زنجیرە پرسیارە کۆکراوەکان لەگەڵ نوێترین داتاکانی GenBank و سەنتەری نیشتمانی بۆ زانیاری بایۆتەکنەلۆژیا (NCBI، http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) بە بەکارهێنانی نەرمەکاڵای BLASTn بەراورد کران. زنجیرەی پرسیارەکان بەراورد کرا لەگەڵ 20 جۆرە/جیاکراوەکانی تری S. sclerotiorum کە لە نوێترین داتاکان لە NCBI GenBank وەرگیراون (خشتەی تەواوکەری S1) بە بەکارهێنانی ClustalW لە پاکێجی شیکاری جیناتیکی پەرەسەندنی گۆگردی (MEGA-11؛ وەشانی 11) (Kumar et al., 2024). شیکاری پەرەسەندن بە بەکارهێنانی ڕێگەی زۆرترین ئەگەر و مۆدێلی جێگرەوەی نیوکلیۆتایدی گشتی کات-گەڕاوە ئەنجامدرا (Nei and Kumar, 2000). ئەو دارەی زۆرترین ئەگەری لۆگی هەیە نیشان دراوە. دارە سەرەتاییەکە بۆ گەڕانی هێوریستی بە هەڵبژاردنی ئەو دارە هەڵدەبژێردرێت کە ئەگەری لۆگی زیاتری هەیە لە نێوان درەختی دراوسێ-یەکگرتن (NJ) (Kumar et al., 2024) و دارە زۆرترین پارسیمۆنی (MP). درەختی NJ بە بەکارهێنانی ماتریکسی مەودای جووتە دروستکراوە کە بە بەکارهێنانی مۆدێلی گشتی کات-گەڕاوە حیسابی بۆ کراوە (Nei and Kumar, 2000).
چالاکیی دژە بەکتریاکانی L-ornithine و بەکتریاکوژی "Rizolex-T" لە ناو ئامێری پشکنیندا بە شێوازی بڵاوبوونەوەی ئاگار دیاریکرا. شێواز: بڕی گونجاوی گیراوەی کۆگای L-ornithine (500 mg/L) وەربگرە و بە باشی تێکەڵ بکە لەگەڵ 10 مل لە ناوەندی خۆراکی PDA بۆ ئامادەکردنی گیراوەکان بە چڕیی کۆتایی 12.5، 25، 50، 75، 100 و 125 mg/L، بە ڕێککەوت. پێنج چڕیی قارچککوژ "Rizolex-T" (2، 4، 6، 8 و 10 میلیگرام/لیتر) و ئاوی تەعقیمکراوی تەعقیمکراو وەک کۆنتڕۆڵ بەکارهێنران. دوای ئەوەی ناوەندەکە ڕەق بووەوە، پڵاگێکی میسیلی تازە ئامادەکراوی کشتوکاڵی Sclerotinia sclerotiorum، تیرەکەی 4 ملم، گواسترایەوە بۆ ناوەندی قاپی پێتری و لە پلەی گەرمی 25±2 پلەی سەدیدا کشتوکاڵی کرا تاوەکو میسیلیۆمەکە تەواوی قاپەکەی پێتری کۆنترۆڵکراوی داپۆشی، دوای ئەوە گەشەی قارچکەکە تۆمارکرا. ڕێژەی سەدی ڕێگریکردن لە گەشەی تیشکی S. sclerotiorum بە بەکارهێنانی هاوکێشە 1 حیسابی بکە:
تاقیکردنەوەکە دوو جار دووبارەکرایەوە، لەگەڵ شەش دووبارەبوونەوەی بایۆلۆژی بۆ هەر گروپێکی کۆنترۆڵ/تاقیکردنەوە و پێنج گۆزە (دوو ڕووەک بۆ هەر گۆزەیەک) بۆ هەر دووبارەبوونەوەی بایۆلۆژی. هەر دووبارەبوونەوەی بایۆلۆژی دوو جار شیکرایەوە (دوو دووبارەکردنەوەی تەکنیکی) بۆ دڵنیابوون لە وردی و متمانەپێکراوی و دووبارەبوونەوەی ئەنجامە تاقیکارییەکان. سەرەڕای ئەوە، شیکاری پاشەکشەی پرۆبیت بەکارهات بۆ حیسابی نیوە زۆرترین چڕیی ڕێگریکەر (IC50) و IC99 (Prentice, 1976).
بۆ هەڵسەنگاندنی توانای L-ornithine لە ژێر بارودۆخی گەرمخانەدا، دوو تاقیکردنەوەی یەک لە دوای یەک لە گۆزەدا ئەنجامدرا. بە کورتی، دەفرەکان پڕکران لە خاکی تەعقیمکراوی گڵین-خۆڵ (3:1) و کوتێنران بە کلتوری تازە ئامادەکراوی S. sclerotiorum. سەرەتا، داگیرکەرترین جیاکراوەی S. sclerotiorum (جیاوازی #3) بە بڕینی یەک سکلێرۆتیۆم بۆ نیوە کشتوکاڵ کرا، دانانی ڕووی خوارەوە لەسەر PDA و کەرەوزکردنی لە پلەی گەرمی 25 پلەی سەدی لە تاریکی بەردەوام (24 سەعات) بۆ ماوەی 4 ڕۆژ بۆ هاندانی گەشەی میسیلی. پاشان چوار پڵاگەکانی ئاگار بە تیرەی 5 ملم لە لێواری پێشەوە وەرگیران و بە 100 گرام تێکەڵەیەکی تەعقیمکراوی گەنم و بڕبڕەی پشت (1:1، v/v) کوتێنران و هەموو فلاسکەکان لە پلەی گەرمی 25 ± 2 پلەی سەدی لە ژێر خولێکی 12 سەعاتی ڕووناکی/12 سەعاتی تاریکیدا بۆ ماوەی 5 ڕۆژ کەرەوز کران بۆ هاندانی دروستبوونی سکلێرۆتیا. ناوەڕۆکی هەموو فلاسکەکان بە باشی تێکەڵ کران بۆ دڵنیابوون لە یەکسانی پێش زیادکردنی خاک. پاشان، 100 گرام لە تێکەڵەی کۆلۆنیکەری کۆلۆنیکەر بۆ هەر مەنجەڵێک زیادکرا بۆ دڵنیابوون لە چڕیی بەردەوامی ماددە نەخۆشخوازەکان. دەفرە کوتراوەکان ئاویان پێدرا بۆ چالاککردنی گەشەی قارچک و بۆ ماوەی ٧ ڕۆژ لە دۆخی گەرمخانەدا دانران.
پاشان پێنج تۆوی جۆری جیزە ٣ لە هەر گۆزەیەکدا چێندرا. بۆ ئەو مەنجەڵانەی کە بە L-ornithine و قارچککوژ Rizolex-T چارەسەر کراون، سەرەتا تۆوی تەعقیمکراو بۆ ماوەی دوو کاتژمێر لە گیراوەیەکی ئاوی دوو پێکهاتەکەدا تەڕکران بە چڕیی کۆتایی IC99 کە نزیکەی 250 میلیگرام/لیتر و 50 میلیگرام/لیتر بوو، بە ڕێککەوت، و پاشان بە هەوا وشککرانەوە بۆ ماوەی یەک کاتژمێر پێش چاندن. لە لایەکی دیکەوە تۆوەکان لە ئاوی تەعقیمکراوی تەعقیمکراودا وەک کۆنتڕۆڵێکی نەرێنی تەڕ کران. دوای ١٠ ڕۆژ پێش ئاودانی یەکەم، نەمامەکان تەنک دەکرانەوە و تەنها دوو نەمامی ڕێک و پێک لە هەر گۆزەیەکدا دەمێننەوە. سەرەڕای ئەوە، بۆ دڵنیابوون لە تووشبوون بە ئێس. ڕووەکەکانی کۆنترۆڵ بە هەمان شێوە بریندار بوون و بڕێکی یەکسان (0.5 گم) تێکەڵەی کۆلۆنی نەزۆک و کۆلۆنی نەکراو خرایە ناو برینەکەوە و لە ژێر شێی بەرزدا ڕاگیرا بۆ ھاوشێوەکردنی ژینگە بۆ گەشەکردنی نەخۆشی و دڵنیابوون لە یەکدەنگی لە نێوان گروپەکانی چارەسەرکردن.
شێوازی چارەسەرکردن: نەمامەکانی فاسۆلیا بە 500 مل گیراوەی ئاوی L-ornithine (250 mg/l) یان قارچککوژ Rizolex-T (50 mg/l) ئاودرابوون بە ئاودێری خاکەکە، پاشان چارەسەرکردنەکە سێ جار دووبارەکرایەوە لە نێوان 10 ڕۆژدا. کۆنتڕۆڵە چارەسەرکراوەکانی پلاسیبۆ بە 500 مل ئاوی تەعقیمکراوی تەعقیمکراو ئاودێری کران. هەموو چارەسەرەکان لە ژێر بارودۆخی گەرمخانەدا ئەنجامدراون (25 ± 2 پلەی سەدی، 75 ± 1% شێی ڕێژەیی، و ماوەی فۆتۆی 8 سەعات ڕووناکی/16 سەعات تاریکی). هەموو مەنجەڵەکان دوو هەفتە جارێک ئاویان پێدرا و مانگانە بە پێوانەی هاوسەنگ NPK (20-20-20، لەگەڵ 3.6% گۆگرد و وردە توخمەکانی TE؛ تۆوی زەین، میسر) بە چڕیی 3-4 گم/ل بە ڕشاندنی گەڵا بەپێی پێشنیارەکانی جۆری تایبەت و ڕێنماییەکانی بەرهەمهێنەر چارەسەر کران. مەگەر بە پێچەوانەوە ئاماژە نەکرێت، گەڵا پێگەیشتووەکانی تەواو فراوان (گەڵای دووەم و سێیەم لە سەرەوە) لە هەر دووبارەبوونەوەی بایۆلۆژی لە 72 سەعات دوای چارەسەرکردن (hpt) کۆکرانەوە، یەکسان کران، کۆکرانەوە و لە پلەی گەرمی -80 پلەی سەدیدا هەڵگیران بۆ شیکاری زیاتر لەوانە، بەڵام سنووردار نەبووە بە، شوێنی بافتی کیمیایی لە شوێنی خۆیدا لە نیشاندەرەکانی فشاری ئۆکسجینی، پەرۆکسیدکردنی چەوری، ئەنزیمیی و نائەنزیمی دژە ئۆکسێنەرەکان و دەربڕینی جینەکان.
توندی تووشبوون بە قاڵبی سپی هەفتانە 21 ڕۆژ دوای کوتان (dpi) بە بەکارهێنانی پێوەرێکی 1-9 هەڵسەنگێندرا (خشتەی تەواوکەری S2) لەسەر بنەمای پێوەرەکانی Petzoldt و Dickson (1996) کە لەلایەن Teran et al. (٢٠٠٦). بە کورتی، لق و لقەکانی ڕووەکی فاسۆلیا پشکنینیان بۆ کرا کە لە خاڵی کوتانەوە دەستی پێکرد بۆ بەدواداچوون بۆ پێشکەوتنی برینەکان بە درێژایی نێوان گرێکان و گرێکان. پاشان مەودای برینەکە لە خاڵی کوتانەوە تا دوورترین خاڵ بەدرێژایی لق یان لقەکە پێوانە کرا و نمرەی 1-9 بە پشتبەستن بە شوێنی برینەکە دیاری کرا، کە (1) ئاماژەی بە هیچ هەوکردنێکی دیار لە نزیک خاڵی کوتانەکە کرد و (2-9) ئاماژەی بە زیادبوونی وردە وردەی قەبارەی برینەکە و پێشکەوتن بە درێژایی گرێکان/ناوچەرخەکان کرد (خشتەی تەواوکەری S2). پاشان توندی تووشبوون بە قاڵبی سپی گۆڕدرا بۆ ڕێژەی سەدی بە بەکارهێنانی فۆرمۆلەی ٢:
سەرەڕای ئەوەش، ڕووبەری ژێر کێوی پێشکەوتنی نەخۆشی (AUDPC) بە بەکارهێنانی فۆرمولەی (Shaner and Finney, 1977) حیسابی بۆ کرا، کە بەم دواییە بۆ ڕوتانەوەی سپی فاسۆلیا باو گونجاو بوو (Chauhan et al., 2020) بە بەکارهێنانی هاوکێشە 3:
کە Yi = توندی نەخۆشی لە کاتی ti، Yi+1 = توندی نەخۆشی لە کاتی داهاتوودا ti+1، ti = کاتی پێوانەکردنی یەکەم (بە ڕۆژ)، ti+1 = کاتی پێوانەکردنی داهاتوو (بە ڕۆژ)، n = کۆی ژمارەی خاڵە کاتییەکان یان خاڵەکانی چاودێریکردن. پارامێتەرەکانی گەشەی ڕووەکی فاسۆلیا لەوانەش بەرزی ڕووەک (سم)، ژمارەی لقەکان بۆ هەر ڕووەکێک، و ژمارەی گەڵاکان بۆ هەر ڕووەکێک هەفتانە بۆ ماوەی ٢١ ڕۆژ لە هەموو دووبارەبوونەوەی بایۆلۆژیدا تۆمارکران.
لە هەر دووبارەبوونەوەی بایۆلۆژیدا، نمونەی گەڵاکان (گەڵاکانی دووەم و سێیەم کە بە تەواوی گەشەیان کردووە لە سەرەوە) لە ڕۆژی ٤٥ دوای چارەسەرکردن (١٥ ڕۆژ دوای دوا چارەسەرکردن) کۆکرانەوە. هەر دووبارەبوونەوەی بایۆلۆژی لە پێنج گۆزە پێکهاتبوو (دوو ڕووەک بۆ هەر گۆزەیەک). نزیکەی 500 میلیگرام لە شانە وردکراوەکان بۆ دەرهێنانی ڕەنگە فۆتۆسێنتێزەکان (کلۆرۆفیل a، کلۆرۆفیل b و کارۆتینۆیدەکان) بەکارهێنرا بە بەکارهێنانی 80% ئەسیتۆن لە پلەی گەرمی 4 پلەی سەدی لە تاریکیدا. دوای 24 سەعات، نموونەکان سەنتەرفۆج کران و شلەی سەرەوە کۆکرایەوە بۆ دیاریکردنی ناوەڕۆکی کلۆرۆفیل a، کلۆرۆفیل b و کارۆتینۆید بە شێوەیەکی ڕەنگپێوان بە بەکارهێنانی سپێکترۆفۆتۆمێتری UV-160A (Shimadzu Corporation, Japan) بەپێی شێوازی (Lichtenthaler, 1987) بە پێوانی مژینی لە سێ درێژی شەپۆلی جیاوازدا (A470، A646 و A663 نانۆمەتر). لە کۆتاییدا، ناوەڕۆکی ڕەنگە فۆتۆسێنتێزەکان بە بەکارهێنانی ئەم فۆرمولانەی خوارەوە 4-6 کە لەلایەن Lichtenthaler (1987) باسکراون حیسابی بۆ کرا.
لە 72 سەعات دوای چارەسەرکردن (hpt)، گەڵاکان (گەڵای دووەم و سێیەمی تەواو گەشەسەندوو لە سەرەوە) لە هەر دووبارەبوونەوەی بایۆلۆژی کۆکرانەوە بۆ شوێنی بافتی کیمیایی لە شوێنی خۆیدا پەرۆکسایدی هایدرۆجین (H2O2) و ئەنیۆنی سوپەر ئۆکسیدی (O2•−). هەر دووبارەبوونەوەی بایۆلۆژی لە پێنج گۆزە پێکهاتبوو (دوو ڕووەک بۆ هەر گۆزەیەک). هەر دووبارەبوونەوەی بایۆلۆژی بە دووبارە (دوو دووبارەکردنەوەی تەکنیکی) شیکرایەوە بۆ دڵنیابوون لە وردی و متمانەپێکراوی و دووبارەبوونەوەی شێوازەکە. H2O2 و O2•− بە بەکارهێنانی 0.1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) یان تێترازۆلیۆمی نایترۆبلو (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany)، بە ڕێککەوت، بەپێی ئەو ڕێگایانەی کە لەلایەن Romero-Puertas et al. (2004) و ئادەم و هاوکارانی. (1989) بە گۆڕانکاری بچووک. بۆ شوێنی بافتی کیمیایی H2O2 لە شوێنی خۆیدا، نامیلکەکان بە بۆشایی بە 0.1% DAB لە 10 میلی مۆلی تریس بافەر (pH 7.8) دزەیان پێکرا و پاشان لە پلەی گەرمی ژووردا لە ڕووناکیدا بۆ ماوەی 60 خولەک کەرەوز کران. نامیلکەکان لە 0.15% (v/v) TCA لە 4:1 (v/v) ئیتانۆل:کلۆرۆفۆرم (دەرمان و پێداویستییە پزیشکییەکانی ئەلگۆمهۆریا، قاهیرە، میسر) سپیکرانەوە و پاشان بەر ڕووناکی کەوتن تاوەکو تاریک بوون. بە هەمان شێوە، وەلڤەلەکان بە بۆشایی بە 10 میلی مۆلی پۆتاسیۆم فۆسفات بافەر (pH 7.8) کە 0.1 w/v % HBTی تێدابوو بۆ شوێنی بافتی کیمیایی O2•− لە شوێنی خۆیدا دزەیان پێکرا. نامیلکەکان لەناو ڕووناکیدا لە پلەی گەرمی ژووردا بۆ ماوەی ٢٠ خولەک کەرەوز کران، پاشان وەک سەرەوە سپیکرانەوە، و پاشان ڕووناککرانەوە تاوەکو پەڵەی شین/بەنۆکیی تۆخ دەرکەوت. چڕی ڕەنگی قاوەیی (وەک نیشاندەری H2O2) یان شین-بەنۆک (وەک نیشاندەری O2•−)ی دەرەنجامی بە بەکارهێنانی وەشانی فیجیی پاکێجی پرۆسێسکردنی وێنە ImageJ هەڵسەنگێندرا (http://fiji.sc؛ دەستگەیشتن بە 7 ئازاری 2024).
مالۆندیالدەهید (MDA؛ وەک نیشاندەری پەرۆکسیدبوونی چەوری) بەپێی شێوازی Du و Bramlage (1992) بە گۆڕانکارییەکی کەم دیاریکرا. گەڵاکانی هەر دووبارەبوونەوەی بایۆلۆژی (گەڵای دووەم و سێیەمی تەواو گەشەسەندوو لە سەرەوە) 72 سەعات دوای چارەسەرکردن (hpt) کۆکرانەوە. هەر دووبارەبوونەوەی بایۆلۆژی پێنج گۆزەی لەخۆگرتبوو (دوو ڕووەک بۆ هەر گۆزەیەک). هەر دووبارەبوونەوەی بایۆلۆژی بە دووبارە (دوو دووبارەکردنەوەی تەکنیکی) شیکرایەوە بۆ دڵنیابوون لە وردی و متمانەپێکراوی و دووبارەبوونەوەی شێوازەکە. بە کورتی، 0.5 گرام شانە گەڵا وردکراوەکان بۆ دەرهێنانی MDA بەکارهێنرا لەگەڵ 20% ترشی تریکلۆرۆئەسیتیک (TCA؛ MilliporeSigma، Burlington، MA، USA) کە 0.01% هایدرۆکسیتۆلۆینی بوتیلکراو (BHT؛ Sigma-Aldrich، سانت لویس، MO، ئەمریکا)ی تێدابوو. پاشان ناوەڕۆکی MDA لە سەرەوەی شلەکەدا بە شێوەی ڕەنگپێوان دیاریکرا بە پێوانی مژینی لە 532 و 600 نانۆمەتر بە بەکارهێنانی سپێکترۆفۆتۆمێتری UV-160A (Shimadzu Corporation، Japan) و پاشان بە nmol g−1 FW دەربڕدرا.
بۆ هەڵسەنگاندنی دژە ئۆکسێنەرە نائەنزیمییەکان و ئەنزیمییەکان، گەڵاکان (گەڵای دووەم و سێیەمی تەواو گەشەسەندوو لە سەرەوە) لە هەر دووبارەبوونەوەی بایۆلۆژی لە 72 سەعات دوای چارەسەرکردن (hpt) کۆکرانەوە. هەر دووبارەبوونەوەی بایۆلۆژی لە پێنج گۆزە پێکهاتبوو (دوو ڕووەک بۆ هەر گۆزەیەک). هەر نمونەیەکی بایۆلۆژی بە دووبارە شیکرایەوە (دوو نمونەی تەکنیکی). دوو گەڵا بە نایترۆجینی شل وردکران و ڕاستەوخۆ بۆ دیاریکردنی دژە ئۆکسێنەرە ئەنزیمییەکان و نائەنزیمییەکان، کۆی ترشە ئەمینییەکان، ناوەڕۆکی پرۆلین، دەربڕینی جینەکان و ژماردنی ئۆکسالات بەکارهێنران.
کۆی گشتی فینۆلیکە تواوەکان بە بەکارهێنانی کاراکتەری فۆلین-سیۆکالتێو (سیگما-ئاڵدریچ، سانت لویس، MO، ئەمریکا) لەگەڵ گۆڕانکارییەکی کەم لە شێوازەکە دیاریکرا کە لەلایەن Kahkonen et al. (١٩٩٩). بە کورتی، نزیکەی 0.1 گرام شانە گەڵا یەکسانکراوەکان لەگەڵ 20 مل 80% مێتانۆل لە تاریکیدا بۆ ماوەی 24 سەعات دەرهێنرا و شلەی سەرەوە دوای سەنتەرفۆج کۆکرایەوە. 0.1 مل لە دەرهاویشتەی نمونەکە لەگەڵ 0.5 مل کاراکتەری فۆلین-سیۆکاڵتیو (10%) تێکەڵکرا، بۆ ماوەی 30 چرکە لەرزێندرا و بۆ ماوەی 5 خولەک لە تاریکیدا بەجێهێڵدرا. پاشان 0.5 مل گیراوەی 20% کاربۆناتی سۆدیۆم (Na2CO3؛ کۆمپانیای دەرمان و پێداویستی پزیشکی Al-Gomhoria، قاهیرە، میسر) زیادکرا بۆ هەر بۆرییەک، بە باشی تێکەڵکرا و لە پلەی گەرمی ژووردا لە تاریکیدا بۆ ماوەی 1 کاتژمێر کەرەوزکرا. دوای کەرەوزکردن، توانای مژینی تێکەڵەی کارلێکەکە لە 765 نانۆمەتردا پێوانە کرا بە بەکارهێنانی سپێکترۆفۆتۆمێتری UV-160A (Shimadzu Corporation، Japan). چڕیی کۆی گشتی فینۆڵە تواوەکان لە دەرهێنراوەکانی نمونەدا بە بەکارهێنانی کێوی قەبارەدانانی ترشی گالیک (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) دیاریکرا و بە میلیگرام ترشی گالیک هاوتا بۆ هەر گرامێک کێشی تازە (mg GAE g-1 کێشی تازە) دەربڕدرا.
کۆی گشتی ڕێژەی فلاڤۆنۆیدی تواوە بەپێی شێوازی Djeridane et al. (2006) بە گۆڕانکارییەکی کەم. بە کورتی، 0.3 مل لە دەرهاویشتەی مێتانۆلی سەرەوە لەگەڵ 0.3 مل گیراوەی 5% کلۆریدی ئەلەمنیۆم (AlCl3؛ Fisher Scientific، Hampton, NH, USA) تێکەڵکرا، بە توندی تێکەڵکرا و پاشان لە پلەی گەرمی ژووردا بۆ ماوەی 5 خولەک کەرەوزکرا، دواتر 0.3 مل لە گیراوەی 10% ئەسیتاتی پۆتاسیۆم (Al-Gomhoria) زیادکرا دەرمان و پێداویستی پزیشکی، قاهیرە، میسر)، بە باشی تێکەڵ کراوە و لە پلەی گەرمی ژووردا بۆ ماوەی ٣٠ خولەک لە تاریکیدا کەرەوز کراوە. دوای کەرەوزکردن، توانای مژینی تێکەڵەی کارلێکەکە لە 430 نانۆمەتردا پێوانە کرا بە بەکارهێنانی سپێکترۆفۆتۆمێتری UV-160A (Shimadzu Corporation، Japan). چڕیی کۆی گشتی فلاڤۆنۆیدە تواوەکان لە دەرهێنراوەکانی نمونەدا بە بەکارهێنانی کێوی قەبارەدانانی ڕوتین دیاریکرا (TCI America, Portland, OR, USA) و پاشان بە میلیگرام هاوتای ڕوتین بۆ هەر گرامێک کێشی تازە (mg RE g-1 کێشی تازە) دەربڕدرا.
کۆی گشتی ڕێژەی ترشە ئەمینییە ئازادەکانی گەڵاکانی فاسۆلیا بە بەکارهێنانی کاراکتەری نینهایدرین دەستکاریکراو (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) دیاریکرا لەسەر بنەمای ئەو ڕێگایەی کە لەلایەن Yokoyama و Hiramatsu (2003) پێشنیار کراوە و دەستکاری کراوە لەلایەن Sun et al. (٢٠٠٦). بە کورتی، 0.1 گرام شانە وردکراوەکان بە بافەری pH 5.4 دەرهێنرا، و 200 میکرۆلیتر لە شلەی سەرەوە لەگەڵ 200 میکرۆلیتر نینهیدرین (2%) و 200 میکرۆلیتر پیریدین (10%؛ سپێکترۆم کیمیایی، نیو برانسویک، نیوجرسی، ئەمریکا) کارلێک کرا، لە حەمامێکی ئاوی کوڵاودا بۆ ماوەی 30 خولەک کەرەوزکرا، پاشان ساردکرایەوە و لە پلەی گەرمی 580 نانۆمەتر بە بەکارهێنانی سپێکترۆفۆتۆمێتری UV-160A (کۆمپانیای شیمادزو، ژاپۆن). لە لایەکی دیکەوە، پرۆلین بە شێوازی بەیتس دیاریکرا (Bates et al., 1973). پرۆلین بە 3% ترشی سولفۆسالیسیلیک (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) دەرهێنرا و دوای سەنتەرفۆجکردن، 0.5 مل لە شلەی سەرەوە لەگەڵ 1 مل ترشی ئەسیک سەهۆڵبەندان (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) و کاراکتەری نینهیدرین تێکەڵکرا، لە پلەی گەرمی 90 پلەی سەدی بۆ ماوەی 45 خولەک کەرەوزکرا، ساردکرایەوە و لە پلەی گەرمی پێوانەکرا 520 نانۆمەتر بە بەکارهێنانی هەمان سپێکترۆفۆتۆمێتەر وەک سەرەوە. کۆی گشتی ترشە ئەمینییە ئازادەکان و پرۆلین لە دەرهێنراوەکانی گەڵاکاندا بە بەکارهێنانی کێشەکانی قەبارەدانانی گلیسین و پرۆلین (سیگما-ئاڵدریچ، سانت لویس، MO، ئەمریکا)، بە ڕێککەوت دیاریکرا و بە میلیگرام/گرام کێشی تازە دەربڕدرا.
بۆ دیاریکردنی چالاکیی ئەنزیمیی ئەنزیمە دژە ئۆکسێنەرەکان، نزیکەی 500 میلیگرام شانە یەکسانکراوەکان بە 3 مل لە 50 میلی مۆلی تریس بافەر (pH 7.8) دەرهێنرا کە 1 میلی مۆلی EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) و 7.5% پۆلیڤینێلپیرۆلیدۆن (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ئەمریکا)، لە 10,000 × g بۆ ماوەی 20 خولەک لە ژێر ساردکەرەوە (4 °C) سەنتەرفۆج کرا، و شلەی سەرەوە (دەرهێنانی ئەنزیمێکی خاو) کۆکرایەوە (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). پاشان کاتالاز (CAT) لەگەڵ 2 مل لە 0.1 M سۆدیۆم فۆسفات بافەر (pH 6.5؛ Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) و 100 میکرۆلیتر گیراوەی 269 mM H2O2 کارلێک کرا بۆ دیاریکردنی چالاکیی ئەنزیمییەکەی بەپێی شێوازی Aebi (1984) لەگەڵ گۆڕانکارییەکی کەم (El-Nagar et al., 2023; عوسمان و هاوکارانی، ٢٠٢٣). چالاکیی ئەنزیمیی پەرۆکسیدایز وابەستە بە گوایکۆل (POX) بە بەکارهێنانی ڕێگەی Harrach et al. (٢٠٠٩). (2008). ئەمریکا) و 100 میکرۆلیتر 12 میلی مۆلی H2O2. شێوازەکە کەمێک دەستکاری کراوە لە (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). تاقیکردنەوەکە دوای کارلێککردن لەگەڵ 3 مل گیراوەی کاتێکۆل (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0.01 M) کە تازە لە 0.1 M فۆسفات بافەر (pH 6.0) ئامادەکرابوو ئەنجامدرا. چالاکیی CAT بە چاودێریکردنی شیبوونەوەی H2O2 لە 240 نانۆمەتر (A240) پێوانە کرا، چالاکیی POX بە چاودێریکردنی زیادبوونی مژینی لە 436 نانۆمەتر (A436) پێوانە کرا، و چالاکیی PPO بە تۆمارکردنی هەڵاوسانی مژینی لە 495 نانۆمەتر (A495) هەر 30 چرکەیەک بۆ ماوەی 3 خولەک بە بەکارهێنانی UV-160A پێوانە کرا سپێکترۆفۆتۆمێتەر (شیمادزو، ژاپۆن).
RT-PCR لە کاتی ڕاستەقینەدا بەکارهات بۆ دیاریکردنی ئاستی نووسینەوەی سێ جینی پەیوەست بە دژە ئۆکسێنەر، لەوانەش پەرۆکسیزۆمی کاتالاز (PvCAT1؛ GenBank Accession No. KF033307.1)، سوپەر ئۆکساید دیسموتاز (PvSOD؛ GenBank Accession No. XM_068639556.1)، و گلوتاتیون ڕیداکتاز (PvGR؛ GenBank Accession No. KY195009.1)، لە گەڵاکانی فاسۆلیا (گەڵای دووەم و سێیەم بە تەواوی گەشەسەندوو لە سەرەوە) 72 سەعات دوای دوا چارەسەرکردن. بە کورتی، RNA بە بەکارهێنانی Simply P Total RNA Extraction Kit (ژمارەی پشیلە BSC52S1؛ BioFlux، Biori Technology، China) بەپێی پرۆتۆکۆڵی بەرهەمهێنەر جیاکرایەوە. پاشان، cDNA بە بەکارهێنانی TOP scriptTM cDNA Synthesis Kit بەپێی ڕێنماییەکانی بەرهەمهێنەر دروستکرا. زنجیرە پرایمەرەکانی سێ جینی سەرەوە لە خشتەی تەواوکەری S3 دا هاتووە. PvActin-3 (ژمارەی پەیوەستبوونی GenBank: XM_068616709.1) وەک جینی ماڵەوە بەکارهات و دەربڕینی جینی ڕێژەیی بە بەکارهێنانی ڕێگەی 2-ΔΔCT حیسابی بۆ کرا (Livak and Schmittgen, 2001). سەقامگیری ئەکتین لە ژێر فشاری بایۆتیکدا (کارلێکی ناتەبا لە نێوان گەنمەشامی باو و قارچکی ئەنتراکنۆز Colletotrichum lindemuthianum) و فشاری نازیندەیی (وشکەساڵی، شووتی، پلەی گەرمی نزم) نیشاندرا (Borges et al., 2012).
ئێمە سەرەتا شیکارییەکی جینۆممان لە سیلیکۆدا ئەنجامدا بۆ پڕۆتینەکانی ئۆکسالۆئەسیتات ئەسیتیلهایدرۆلاز (OAH) لە S. sclerotiorum بە بەکارهێنانی ئامرازی پڕۆتین-پڕۆتینی BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). بە کورتی، ئێمە OAHمان لە Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH؛ تاکساید: 1191702؛ ژمارەی پەیوەستبوونی GenBank XP_040799428.1؛ 342 ترشی ئەمینی) و Penicillium lagena (PlOAH؛ تاکساید: 94218؛ ژمارەی پەیوەستبوونی GenBank بەکارهێنا XP_056833920.1؛ 316 ترشی ئەمینی) وەک زنجیرەی پرسیار بۆ نەخشەی پڕۆتینی هاوشێوە لە S. sclerotiorum (تاکسید: 5180). BLASTp لە بەرامبەر دوایین داتاکانی جینۆمی S. sclerotiorum لە GenBank لە ماڵپەڕی سەنتەری نیشتمانی بۆ زانیاری بایۆتەکنەلۆژیا (NCBI)، http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ ئەنجامدرا.
سەرەڕای ئەوە، جینی پێشبینیکراوی OAH لە S. sclerotiorum (SsOAH) و شیکاری پەرەسەندن و دارە فایلۆجینێتیکییەکانی AfOAH لە A. fijiensis CBS 313.89 و PlOAH لە P. lagena بە بەکارهێنانی ڕێگەی زۆرترین ئەگەر لە MEGA11 (Tamura et al., 2021) و مۆدێلی بنەمادار بە ماتریکسی JTT (Jones et هاوکارانی، ١٩٩٢). درەختی فایلۆجینێتیک لەگەڵ شیکاری ڕێکخستنی فرەیی زنجیرە پڕۆتینییەکانی هەموو جینەکانی OAH پێشبینیکراو (SsOAH) لە S. sclerotiorum و زنجیرەی پرسیارکردن بە بەکارهێنانی ئامرازی ڕێکخستنی بنەمادار بە سنووردارکردن (COBALT؛ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos و Agarwala, ٢٠٠٧). سەرەڕای ئەوە، باشترین زنجیرە ترشە ئەمینییە هاوتاکانی SsOAH لە S. sclerotiorum لەگەڵ زنجیرەکانی پرسیار (AfOAH و PlOAH) (Larkin et al., 2007) بە بەکارهێنانی ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) ڕێکخران، و ناوچە پارێزراوەکان لە ڕێکخستنەکەدا بە بەکارهێنانی ئامرازی ESPript (وەشان 3.0) بینران؛ https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/ئیندێکس.php).
سەرەڕای ئەوە، دۆمەینی نوێنەری کارایی پێشبینیکراو و شوێنە پارێزراوەکانی S. sclerotiorum SsOAH بە شێوەیەکی کارلێککارانە پۆلێن کران بۆ خێزانە جیاوازەکان بە بەکارهێنانی ئامرازی InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). لە کۆتاییدا، مۆدێلکردنی پێکهاتەی سێ ڕەهەندی (3D)ی پێشبینیکراوی S. sclerotiorum SsOAH بە بەکارهێنانی بزوێنەری ناسینەوەی هاوشێوەیی پڕۆتین/ئەنالۆجی ئەنجامدرا (Phyre2 server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) و بە بەکارهێنانی پشتڕاستکرایەوە سێرڤەری SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). پێکهاتە سێ ڕەهەندییە پێشبینیکراوەکان (فۆرماتە PDB) بە شێوەیەکی کارلێککارانە بە بەکارهێنانی پاکێجی UCSF-Chimera (وەشان 1.15؛ https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) بینران (Pettersen et al., 2004).
PCRی فلۆرۆسەنسی کاتی ڕاستەقینەی چەندایەتی بەکارهات بۆ دیاریکردنی ئاستی نووسینەوەی ئۆکسالۆئەسیتات ئەسیتیلهایدرۆلاز (SsOAH؛ ژمارەی پەیوەستبوونی GenBank: XM_001590428.1) لە میسیلیای Sclerotinia sclerotiorum. بە کورتی، S. sclerotiorum لەناو فلاسکێکدا کە PDB ی تێدابوو کوتێنرا و لەناو ئینکوباتۆرێکی لەرزۆکدا دانرا (مۆدێل: I2400، کۆمپانیای زانستی نیو برانسویک، ئێدیسۆن، NJ، ئەمریکا) لە پلەی گەرمی 25 ± 2 پلەی سەدی بۆ ماوەی 24 سەعات بە خێرایی 150 خولەکە لە خولەکێکدا و لە تاریکییەکی بەردەوام (24 سەعات) بۆ هاندانی گەشەی میسیلیال. دواتر، خانەکان بە L-ornithine و قارچککوژ Rizolex-T لە چڕیی کۆتایی IC50 (نزیکەی 40 و 3.2 mg/L، بە ڕێککەوت) چارەسەر کران و پاشان بۆ ماوەی 24 سەعاتی دیکە لە ژێر هەمان بارودۆخدا کشتوکاڵ کران. دوای کەرەوزکردن، کولتوورەکان بە خێرایی 2500 خولەک لە خولەکێکدا بۆ ماوەی 5 خولەک سەنتەرفۆج کران و شلەی سەرەوە (مایسلیۆمی قارچکی) کۆکرایەوە بۆ شیکاری دەربڕینی جینەکان. بە هەمان شێوە، مایسلیۆمی قارچکی لە 0، 24، 48، 72، 96 و 120 سەعات دوای تووشبوون لە ڕووەکە تووشبووەکان کۆکرایەوە کە قاڵبی سپی و مایسلیۆمی پەتوویان لەسەر ڕووی شانە تووشبووەکان دروستکردبوو. RNA لە مایسلیۆمی قارچک دەرهێنرا و پاشان cDNA وەک لە سەرەوە باسکراوە دروستکرا. زنجیرەکانی پرایمەر بۆ SsOAH لە خشتەی تەواوکەری S3 دا هاتووە. SsActin (ژمارەی پەیوەستبوونی GenBank: XM_001589919.1) وەک جینی ماڵەوە بەکارهات، و دەربڕینی جینی ڕێژەیی بە بەکارهێنانی ڕێگەی 2-ΔΔCT حیسابی بۆ کرا (Livak and Schmittgen, 2001).
ترشی ئۆکسالیک لە شۆربای دیکسترۆزی پەتاتە (PDB) و نمونەی ڕووەک کە مادەی نەخۆشخواز قارچکی Sclerotinia sclerotiorum ی تێدایە بەپێی شێوازی Xu و Zhang (2000) بە گۆڕانکارییەکی کەم دیاریکرا. بە کورتی، جیاکراوەکانی S. sclerotiorum لەناو فلاسکەکاندا کوتێنران کە PDBیان تێدابوو و پاشان لە ئینکوباتۆرێکی لەرزۆکدا (مۆدێلی I2400، کۆمپانیای زانستی نیو برانسویک، ئێدیسۆن، NJ، ئەمریکا) بە خێرایی 150 خولەک لە خولەکێکدا لە پلەی گەرمی 25 ± 2 پلەی سەدی بۆ ماوەی 3-5 ڕۆژ لە تاریکییەکی بەردەوام (24 سەعات)دا کشتوکاڵ کران بۆ هاندانی گەشەی میسیلیال. دوای کەرەوزکردن، سەرەتا کشتوکاڵی قارچک لە ڕێگەی کاغەزی فلتەری Whatman #1 فلتەر کرا و پاشان بە خێرایی 2500 خولەک لە خولەکێکدا بۆ ماوەی 5 خولەک سەنتەرفۆج کرا بۆ لابردنی پاشماوەی میسیلیۆم. شلەی سەرەوە کۆکرایەوە و لە پلەی گەرمی 4 پلەی سەدیدا هەڵگیرا بۆ دیاریکردنی چەندایەتی زیاتری ئۆکسالات. بۆ ئامادەکردنی نمونەی ڕووەک، نزیکەی 0.1 گرام پارچەی شانەکانی ڕووەک سێ جار بە ئاوی پاککراوە دەرهێنرا (2 مل بۆ هەر جارێک). پاشان نموونەکان بە خێرایی 2500 خولەکە لە خولەکێکدا بۆ ماوەی 5 خولەک سەنتەرفۆج کران، شلەی سەرەوە بە وشکی لە ڕێگەی کاغەزی فلتەری واتمان ژمارە 1ەوە فلتەر کرا و کۆکرایەوە بۆ شیکاری زیاتر.
بۆ شیکاری چەندایەتی ترشی ئۆکسالیک، تێکەڵەی کارلێکەکە لە بۆرییەکی شووشەی کۆتاییدا بەم ڕیزبەندییە ئامادەکرا: 0.2 مل نمونە (یان پاڵاوتەی کشتوکاڵی PDB یان گیراوەی ستانداردی ترشی ئۆکسالیک)، 0.11 مل شین برۆمۆفینۆڵ (BPB، 1 میلی مۆلی؛ فیشەر کیمیایی، پیتسبورگ، PA، ئەمریکا)، 0.198 مل ترشی سولفوریک 1 مل (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) and 0.176 ml of 100 mM potassium dichromate (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), and then the solution was diluted to 4.8 ml with distilled water, vigorously mixed and immediately placed in a 60 °C water گەرماو. دوای 10 خولەک، کارلێکەکە بە زیادکردنی 0.5 مل گیراوەی سۆدیۆم هایدرۆکساید (NaOH؛ 0.75 M) وەستا. توانای مژینی (A600)ی تێکەڵەی کارلێکەکە لە 600 نانۆمەتر بە بەکارهێنانی سپێکترۆفۆتۆمێتری UV-160 (Shimadzu Corporation، Japan) پێوانە کرا. PDB و ئاوی پاککراوە وەک کۆنتڕۆڵ بۆ ژماردنی پاڵاوتەی کشتوکاڵی و نمونەی ڕووەک بەکارهێنران، بە ڕێککەوت. چڕیی ترشی ئۆکسالیک لە پاڵاوتە کشتوکاڵییەکاندا، کە بە مایکرۆگرام ترشی ئۆکسالیک بۆ هەر ملیلیترێک لە ناوەندی PDB (μg.mL−1) دەربڕدراوە، و لە دەرهێنراوەکانی گەڵادا، کە بە مایکرۆگرام ترشی ئۆکسالیک بۆ هەر گرامێک کێشی تازە (μg.g−1 FW) دەربڕدراوە، بە بەکارهێنانی کێوی قەبارەدانانی ترشی ئۆکسالیک دیاریکرا (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, ئەمریکا).
بە درێژایی توێژینەوەکە، هەموو تاقیکردنەوەکان بە دیزاینێکی تەواو هەڕەمەکی (CRD) دیزاین کراون کە شەش دووبارەکردنەوەی بایۆلۆژی بۆ هەر چارەسەرێک و پێنج گۆزە بۆ هەر دووبارەکردنەوەی بایۆلۆژی (دوو ڕووەک بۆ هەر گۆزەیەک) مەگەر بە پێچەوانەوە ئاماژە نەکرێت. دووبارەبوونەوەی بایۆلۆجی بە دووبارە شیکرانەوە (دوو دووبارەکردنەوەی تەکنیکی). دووبارەکردنەوەی تەکنیکی بەکارهێنرا بۆ پشکنینی توانای دووبارەکردنەوەی هەمان تاقیکردنەوە بەڵام لە شیکاری ئاماریدا بەکارنەهێنرا بۆ ئەوەی دووبارەبوونەوەی ساختە نەبێت. داتاکان بە شێوەیەکی ئاماری بە بەکارهێنانی شیکاری جیاوازی (ANOVA) شیکرانەوە و دواتر تاقیکردنەوەی جیاوازی ڕاستگۆیی بەرچاوی توکی-کرامەر (HSD) (p ≤ 0.05). بۆ تاقیکردنەوەکانی ناو ئامێری پشکنینی دەرەکی، بەهاکانی IC50 و IC99 بە بەکارهێنانی مۆدێلی پرۆبیت حیسابی بۆ کرا و 95% نێوانەکانی متمانە حیسابی بۆ کرا.
بە گشتی چوار جیاکراوە لە کێڵگە جیاوازەکانی سۆیا لە پارێزگای ئەلغابیە لە میسر کۆکرانەوە. لەسەر ناوەندی PDA، هەموو جیاکراوەکان میسیلیۆمی سپی کرێمداریان بەرهەمهێنا کە بە خێرایی سپی پەتوو بوو (شێوەی 1A) و پاشان لە قۆناغی سکلێرۆتیۆمدا ڕەنگی بێج یان قاوەیی بوو. بەزۆری سکلێرۆتیای چڕ، ڕەش، گۆشەیی یان ناڕێک لە شێوەیاندایە، درێژییەکەی ٥.٢ بۆ ٧.٧ ملم و تیرەکەی ٣.٤ بۆ ٥.٣ ملم (شێوەی ١B). هەرچەندە چوار جیاکراوە نەخشێکی پەراوێزی سکلێرۆتیای لە لێواری ناوەندی کشتوکاڵیدا پەرەپێدا دوای 10-12 ڕۆژ لە کەرەوزکردن لە پلەی گەرمی 25 ± 2 پلەی سەدی (شێوەی 1A)، ژمارەی سکلێرۆتیای هەر پلێتێک جیاوازییەکی بەرچاوی لە نێوانیاندا هەبوو (P < 0.001)، لەگەڵ جیاکراوەی 3 زۆرترین ژمارەی سکلێرۆتیایان هەبوو (32.33 ± 1.53 سکرۆتیای هەر پلێتێک پلێت؛ وێنەی 1C). بە هەمان شێوە، جیاکراوە #3 ترشی ئۆکسالیکی زیاتری لە PDB بەرهەم هێنا لە چاو جیاکراوەکانی تر (3.33 ± 0.49 μg.mL−1؛ وێنەی 1D). جیاکراوەی #3 تایبەتمەندییە مۆرفۆلۆژی و وردبینییە تایبەتەکانی قارچکی نەخۆشی ڕووەکی Sclerotinia sclerotiorum نیشان دا. بۆ نموونە، لەسەر PDA، کۆلۆنیەکانی جیاکراوەی #3 بە خێرایی گەشەیان کرد، سپییەکی کرێمیی بوون (شێوەی 1A)، ڕەنگی بێجی پێچەوانە یان زەرد-قاوەیی سەلەمۆنی سووک بوو، و پێویستی بە 6-7 ڕۆژ بوو لە پلەی گەرمی 25 ± 2 پلەی سەدی بۆ ئەوەی بە تەواوی ڕووی پلێتێکی تیرەی 9 سم داپۆشێت. بە پشتبەستن بە تایبەتمەندییە مۆرفۆلۆژی و وردبینییەکانی سەرەوە، جیاکراوەی #3 وەک Sclerotinia sclerotiorum دەستنیشانکرا.
وێنە 1. تایبەتمەندی و نەخۆشخوازبوونی جیاکراوەکانی S. sclerotiorum لە بەرهەمە باوەکانی گەنمەشامی. (A) گەشەی میسێلی چوار جیاکراوەی S. sclerotiorum لەسەر ناوەندی PDA، (B) سکلێرۆتیای چوار جیاکراوەی S. sclerotiorum، (C) ژمارەی سکلێرۆتیا (بۆ هەر پلێتێک)، (D) دەردانی ترشی ئۆکسالیک لەسەر ناوەندی PDB (μg.mL−1)، و (E) توندی نەخۆشی (%)ی چوار جیاکراوەی S. sclerotiorum لەسەر گەنمەشامی بازرگانی هەستیار جۆری جیزە ٣ لە ژێر بارودۆخی گەرمخانەدا. بەهاکان نوێنەرایەتی مامناوەندی ± SD پێنج دووبارەبوونەوەی بایۆلۆژی دەکەن (n = 5). پیتە جیاوازەکان جیاوازییەکی ئاماری گرنگ لە نێوان چارەسەرەکاندا نیشان دەدەن (p < 0.05). (F–H) نیشانە ئاساییەکانی قاڵبی سپی لەسەر لقەکانی سەرەوەی زەوی و سیلیکەکان دەرکەوتن، بە ڕێککەوت، 10 ڕۆژ دوای کوتان بە جیاکراوە #3 (dpi). . ژمارەکانی سەرووی هێڵەکانی پۆلێنکردن ئاماژەن بۆ ڕووپۆشی ناوچەکە (%)، و ژمارەکانی خوارەوەی هێڵەکانی پۆلێنکردن ئاماژەن بۆ درێژی لقەکان.
سەرەڕای ئەوە، بۆ پشتڕاستکردنەوەی نەخۆشی دروستکردن، چوار جیاکراوەی بەدەست هاتووی S. sclerotiorum بەکارهێنران بۆ کوتانی جۆری فاسۆلیای بازرگانی ئامادەیی Giza 3 لە ژێر بارودۆخی گەرمخانەدا، کە لەگەڵ گریمانەکانی کۆچدا یەکدەگرێتەوە (شێوەی 1E). هەرچەندە هەموو جیاکراوەکانی قارچکی بەدەست هێنراو نەخۆشخواز بوون و دەتوانن فاسۆلیا سەوزەکە تووش بکەن (cv. Giza 3)، کە بووە هۆی نیشانە ئاساییەکانی قاڵبی سپی لەسەر هەموو بەشەکانی سەرەوەی زەوی (شێوەی 1F)، بەتایبەتی لەسەر لقەکان (شێوەی 1G) و پۆدەکان (شێوەی 1H) لە 10 ڕۆژ دوای کوتان (dpi)، جیاکراوەی 3 شەڕانگێزترین جیاکراوە بوو لە دوو تاقیکردنەوەی سەربەخۆدا. جیاکراوەی 3 بەرزترین توندی نەخۆشی (%)ی لەسەر ڕووەکی فاسۆلیا هەبوو (24.0 ± 4.0، 58.0 ± 2.0، و 76.7 ± 3.1 لە 7، 14، و 21 ڕۆژ دوای تووشبوون، بە ڕێککەوت؛ وێنەی 1F).
ناسینەوەی داگیرکەرترین جیاکراوەی S. sclerotiorum #3 زیاتر پشتڕاستکرایەوە لەسەر بنەمای ڕێکخستنی فەواصلی نووسراوی ناوخۆیی (ITS) (شێوەی 1I). شیکاری فایلۆجینێتیک لە نێوان جیاکراوەی #3 و 20 جیاکراوەی ئاماژەپێکراو/جۆرەکان لێکچوونی بەرزی (>99%) لە نێوانیاندا نیشان دا. شایەنی باسە کە جیاکراوەی S. sclerotiorum #3 (533 bp) لێکچوونێکی بەرزی هەیە لەگەڵ جیاکراوەی S. sclerotiorum ئەمریکی LPM36 کە لە تۆوی نۆکی وشک جیاکراوەتەوە (ژمارەی پەیوەستبوونی GenBank MK896659.1؛ 540 bp) و جیاکراوەی S. sclerotiorum چینی YKY211 (ژمارەی پەیوەندی GenBank OR206374.1؛ زنجیرە نوێیەکە لە بنکەدراوەی NCBI دانراوە و ناوی لێنراوە "Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25" (ژمارەی پەیوەستبوونی GenBank PV202792). دەتوانرێت ببینرێت کە جیاکراوەی ٣ داگیرکەرترین دابڕاوە؛ بۆیە، ئەم جیاکراوە هەڵبژێردرا بۆ لێکۆڵینەوە لە هەموو تاقیکردنەوەکانی دواتر.
چالاکیی دژە بەکتریاکانی دیامین L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) بە چڕیی جیاواز (12.5، 25، 50، 75، 100 و 125 mg/L) دژی جیاکراوەی S. sclerotiorum 3 لە ناو ئامێری پشکنیندا لێکۆڵینەوەی لەسەر کرا. جێگای سەرنجە کە L-ornithine کاریگەری دژە بەکتریا هەبوو و وردە وردە گەشەی تیشکی S. sclerotiorum hyphae ی بە شێوەیەکی وابەستە بە ژەمە دەرمانەکە ڕێگری لێکرد (شێوەی 2A، B). لە بەرزترین چڕیی تاقیکراوی (125 میلیگرام/لیتر)، L-ornithine بەرزترین ڕێژەی ڕێگریکردن لە گەشەی میسێلی نیشان دا (99.62 ± 0.27%؛ وێنەی 2B)، کە هاوتای بوو لەگەڵ قارچککوژی بازرگانی Rizolex-T (رێژەی ڕێگریکردن 99.45 ± 0.39%؛ وێنەی 2C) لە بەرزترین چڕیی تاقیکراوی (10 میلیگرام/لیتر)، کە ئاماژەیە بۆ هاوشێوە کاریگەری.
وێنە 2. چالاکیی دژە بەکتریا لەناو ئامێری پشکنیندا لە L-ornithine دژی Sclerotinia sclerotiorum. (A) بەراوردکردنی چالاکیی دژە بەکتریا لە چڕیی جیاوازی L-ornithine دژی S. sclerotiorum لەگەڵ قارچککوژی بازرگانی Rizolex-T (10 mg/L). (B، C) ڕێژەی ڕێگریکردن (%) گەشەی مایسلیلی S. sclerotiorum دوای چارەسەرکردن بە چڕیی جیاوازی L-ornithine (12.5، 25، 50، 75، 100 و 125 mg/L) یان Rizolex-T (2، 4، 6، 8 و 10 mg/L)، بە ڕێککەوت. بەهاکان نوێنەرایەتی مامناوەندی ± SD پێنج دووبارەبوونەوەی بایۆلۆژی دەکەن (n = 5). پیتە جیاوازەکان جیاوازی ئاماری لە نێوان چارەسەرەکاندا نیشان دەدەن (p < 0.05). (D, E) شیکاری پاشەکشەی مۆدێلی پرۆبیتی L-ornithine و قارچککوژی بازرگانی Rizolex-T، بە ڕێککەوت. هێڵی پاشەکشەی مۆدێلی پرۆبیت وەک هێڵێکی شین و ڕەق نیشان دراوە، و نێوان متمانە (95%) وەک هێڵێکی سووری خاڵی نیشان دراوە.
سەرەڕای ئەوە، شیکاری پاشەکشەی پرۆبیت ئەنجامدرا و پڵۆتە هاوبەشەکان لە خشتەی 1 و وێنەکانی 2D،E دا نیشان دراون. بە کورتی، بەهای مەودای قبوڵکراو (y = 2.92x − 4.67) و ئامارە گرنگەکانی پەیوەندیدار (Cox & Snell R2 = 0.3709، Nagelkerke R2 = 0.4998 و p < 0.0001؛ وێنەی 2D)ی L-ornithine ئاماژەیان بە چالاکیی دژە قارچکی بەرزبووەوە دژی S. sclerotiorum بەراورد بە قارچککوژی بازرگانی ڕیزۆلێکس-T (y = 1.96x − 0.99، کۆکس و سنێل R2 = 0.1242، ناگێلکێرکێ R2 = 0.1708 و p < 0.0001) (خشتەی 1).
خشتەی 1. بەهاکانی نیوە زۆرترین چڕیی ڕێگریکەر (IC50) و IC99 (mg/l)ی L-ornithine و قارچککوژی بازرگانی "Rizolex-T" دژی S. sclerotiorum.
بە گشتی، L-ornithine (250 mg/L) بە شێوەیەکی بەرچاو گەشەکردن و توندی قاڵبی سپی لەسەر ڕووەکی فاسۆلیا باوی چارەسەرکراو کەمکردەوە بە بەراورد لەگەڵ ڕووەکە تووشبووەکانی S. sclerotiorum چارەسەرنەکراو (کۆنتڕۆڵ؛ وێنەی 3A). بە کورتی، هەرچەندە توندی نەخۆشییەکەی ڕووەکە کۆنتڕۆڵکراوەکانی تووشبوو چارەسەرنەکراو وردە وردە زیادی کرد (52.67 ± 1.53، 83.21 ± 2.61، و 92.33 ± 3.06%)، بەڵام L-ornithine بە شێوەیەکی بەرچاو توندی نەخۆشییەکەی کەمکردەوە (%) بە درێژایی تاقیکردنەوەکە (8.97 ± 0.15، 18.00 ± 1.00، و 26.36 ± 3.07) لە 7، 14، و 21 ڕۆژ دوای چارەسەرکردن (dpt)، بە ڕێککەوت (شێوەی 3A). بە هەمان شێوە، کاتێک ڕووەکی فاسۆلیا تووشبوو بە S. sclerotiorum بە 250 میلیگرام/لیتر L-ornithine چارەسەر کران، ڕووبەری ژێر کێوی پێشکەوتنی نەخۆشی (AUDPC) لە 1274.33 ± 33.13 لە کۆنتڕۆڵی چارەسەرنەکراو بۆ 281.03 ± 7.95 کەمیکرد، کە کەمێک کەمتر بوو لە کۆنتڕۆڵی پۆزەتیڤ 50 میلیگرام/لیتر قارچککوژی ڕیزۆلێکس-T (183.61 ± 7.71؛ وێنەی 3B). لە تاقیکردنەوەی دووەمدا هەمان ڕەوت بەدیکرا.
وێنە 3. کاریگەری بەکارهێنانی دەرەکی L-ornithine لەسەر گەشەکردنی ڕوتانەوەی سپی فاسۆلیا باو کە بەهۆی Sclerotinia sclerotiorum لە ژێر بارودۆخی گەرمخانەدا دروست دەبێت. (A) کێوی پێشکەوتنی نەخۆشی قاڵبی سپی فاسۆلیا باو دوای چارەسەرکردن بە 250 میلیگرام/لیتر L-ornithine. (B) ناوچەی ژێر کێوی پێشکەوتنی نەخۆشی (AUDPC)ی قاڵبی سپی فاسۆلیا باو دوای چارەسەرکردن بە L-ornithine. بەهاکان نوێنەرایەتی مامناوەندی ± SD پێنج دووبارەبوونەوەی بایۆلۆژی دەکەن (n = 5). پیتە جیاوازەکان جیاوازییەکی ئاماری گرنگ لە نێوان چارەسەرەکاندا نیشان دەدەن (p < 0.05).
بەکارهێنانی دەرەکی 250 میلیگرام/لیتر L-ornithine وردە وردە بەرزی ڕووەکەکە زیاد دەکات (شێوەی 4A)، ژمارەی لقەکانی بۆ هەر ڕووەکێک (شێوەی 4B)، و ژمارەی گەڵاکانی بۆ هەر ڕووەکێک (شێوەی 4C) دوای 42 ڕۆژ. لە کاتێکدا قارچککوژی بازرگانی Rizolex-T (50 mg/L) زۆرترین کاریگەری لەسەر هەموو پارامێتەرەکانی خۆراکی هەبوو کە لێکۆڵینەوەیان لەسەر کراوە، بەکارهێنانی دەرەکی 250 mg/L L-ornithine دووەم گەورەترین کاریگەری هەبوو بە بەراورد لەگەڵ کۆنتڕۆڵە چارەسەرنەکراوەکان (وێنەکانی 4A-C). لە لایەکی دیکەوە، چارەسەری L-ornithine هیچ کاریگەرییەکی بەرچاوی لەسەر ناوەڕۆکی ڕەنگە فۆتۆسێنتێزەکان کلۆرۆفیل a (شێوەی 4D) و کلۆرۆفیل b (شێوەی 4E) نەبوو، بەڵام کەمێک کۆی ڕێژەی کارۆتینۆیدەکانی زیاد کرد (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) بە بەراورد لەگەڵ کۆنتڕۆڵی نەرێنی (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) و کۆنترۆڵی ئەرێنی (0.46 ± 0.02 میلیگرام/گرام لە کێشدا؛ وێنە 4F). بە گشتی ئەم ئەنجامانە ئاماژە بەوە دەکەن کە L-ornithine ژەهراویکردنی ڕووەکی نییە بۆ گەنمەشامی چارەسەرکراو و تەنانەت ڕەنگە گەشەکردنیان هان بدات.
وێنە 4. کاریگەری بەکارهێنانی دەرەکی L-ornithine لەسەر تایبەتمەندییەکانی گەشەکردن و ڕەنگە فۆتۆسێنتێزەکانی گەڵاکانی فاسۆلیا تووشبوو بە Sclerotinia sclerotiorum لە ژێر بارودۆخی گەرمخانەدا. (A) بەرزی ڕووەکەکە (سم)، (B) ژمارەی لقەکانی هەر ڕووەکێک، (C) ژمارەی گەڵاکانی هەر ڕووەکێک، (D) ڕێژەی کلۆرۆفیل a (mg g-1 fr wt)، (E) ڕێژەی کلۆرۆفیل b (mg g-1 fr wt)، (F) کۆی ڕێژەی کارۆتینۆید (mg g-1 fr wt). بەهاکان مامناوەندی ± SD پێنج دووبارەبوونەوەی بایۆلۆژییە (n = 5). پیتە جیاوازەکان جیاوازییەکی ئاماری گرنگ لە نێوان چارەسەرەکاندا نیشان دەدەن (p < 0.05).
شوێنی بافتکیمیایی لە شوێنی خۆیدا جۆرەکانی ئۆکسجینی کارلێککەر (ROS؛ بە پەرۆکسایدی هایدرۆجین [H2O2] دەربڕدراوە) و ڕادیکاڵە ئازادەکان (بە ئەنیونەکانی سوپەر ئۆکسیدی دەربڕدراون [O2•−]) دەریخست کە بەکارهێنانی دەرەکی L-ornithine (250 mg/L) بە شێوەیەکی بەرچاو کەڵەکەبوونی H2O2 کەمکردەوە (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW؛ وێنە ڕیزۆلێکس-T (170.12 ± 9.50 و 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt، بە ڕێککەوت) لە 72 سەعات. ئاستی بەرزی H2O2 و O2•− لە ژێر hpt کۆبووەوە (شێوەی 5A، B). بە هەمان شێوە، تاقیکردنەوەی مالۆندیالدەهید (MDA) لەسەر بنەمای TCA دەریخست کە ڕووەکی فاسۆلیا تووشبوو بە S. sclerotiorum ئاستی بەرزی MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) لە گەڵاکانیاندا کۆکردۆتەوە (شێوەی 5C). بەڵام، بەکارهێنانی دەرەکی L-ornithine بە شێوەیەکی بەرچاو پەرۆکسیدبوونی چەوری کەمکردەوە وەک بەڵگەی کەمبوونەوەی ڕێژەی MDA لە ڕووەکە چارەسەرکراوەکاندا (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
وێنە 5. کاریگەری بەکارهێنانی دەرەکی L-ornithine لەسەر نیشاندەری سەرەکی فشاری ئۆکسجینی و میکانیزمەکانی بەرگری دژە ئۆکسێنەرە نائەنزیمییەکان لە گەڵاکانی فاسۆلیا تووشبوو بە S. sclerotiorum لە 72 سەعات دوای تووشبوون لە ژێر بارودۆخی گەرمخانەدا. . (E) کۆی گشتی فلاڤۆنۆیدە تواوەکان (mg RE g−1 FW) لە 72 hpt، (F) کۆی گشتی ترشە ئەمینییە ئازادەکان (mg g−1 FW) لە 72 hpt، و (G) ڕێژەی پرۆلین (mg g−1 FW) لە 72 hpt. بەهاکان نوێنەرایەتی مامناوەندی ± لادانێکی ستاندارد (تێکڕا ± SD)ی 5 دووبارەبوونەوەی بایۆلۆژی (n = 5) دەکەن. پیتە جیاوازەکان جیاوازییەکی ئاماری گرنگ لە نێوان چارەسەرەکاندا نیشان دەدەن (p < 0.05).