ئێستا *ناونیشانی ئێستا: کۆڵن 50931، ئەڵمانیا، توێژینەوەی پۆلی نایابی کۆڵن لەسەر وەڵامدانەوەی فشاری خانەیی لە نەخۆشییە پەیوەندیدارەکانی پیربوون (CECAD).
تێکچوونی دەمارەکانی نەخۆشیەکانی مایتۆکۆندریال بە گەڕانەوەنەکراو دادەنرێت چونکە پلاستیسیتی میتابۆلیکی دەمارەکان سنووردارە، بەڵام کاریگەری تێکچوونی کارکردنی مایتۆکۆندریال لەسەر ئۆتۆنۆمی خانەکانی میتابۆلیزمی دەمارەکان لە جەستەدا بە شێوەیەکی خراپ تێگەیشتوون. لێرەدا، ئێمە پرۆتۆئۆمی تایبەتی خانەیی دەمارەکانی پورکینجە دەناسێنین کە کەمی پێشکەوتووی OXPHOS کە بەهۆی تێکچوونی داینامیکی یەکگرتنی مایتۆکۆندریالەوە دروست بووە. ئێمە بۆمان دەرکەوت کە تێکچوونی کارکردنی مایتۆکۆندریال گۆڕانکارییەکی قووڵی لە بواری پرۆتۆئۆمیکدا هێنایە ئاراوە، کە لە کۆتاییدا بووە هۆی چالاکبوونی یەک لە دوای یەک لە بەرنامە وردەکانی گۆڕانکاری پێش مردنی خانەکان. بە شێوەیەکی چاوەڕواننەکراو، ئێمە هێنانەکایەی ئاشکرای پیرۆڤات کاربۆکسیلاز (PCx) و ئەنزیمەکانی تری دژە پیربوونمان دیاریکرد کە تەواوکەری نێوانەکانی خولی TCAن. ڕێگریکردن لە PCx فشاری ئۆکسجینی و تێکچوونی دەمارەکانی توندتر کرد، ئەمەش ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە ڕەقبوونی خوێنبەرەکان کاریگەری پارێزەری هەیە لە دەمارەکاندا کە OXPHOS یان نییە. گەڕاندنەوەی یەکگرتنی مایتۆکۆندریال لە دەمارەخانە تێکچووەکانی کۆتاییدا ئەم تایبەتمەندییە گۆڕانکارییە بە تەواوی پێچەوانە دەکاتەوە، بەمەش ڕێگری لە مردنی خانەکان دەکات. دۆزینەوەکانمان ئەو ڕێگایانە دیاری دەکەن کە پێشتر نەزانراون کە خۆڕاگری دەبەخشن بە تێکچوونی کارکردنی مایتۆکۆندریال و نیشان دەدەن کە دەتوانرێت تێکچوونی دەمارەکان تەنانەت لە قۆناغە درەنگەکانی نەخۆشییەکەدا پێچەوانە بکرێتەوە.
ڕۆڵی ناوەندی مایتۆکۆندریای لە پاراستنی میتابۆلیزمی وزەی دەمارەکاندا بەهۆی نیشانە دەمارییە بەرفراوانەکانی پەیوەست بە نەخۆشییەکانی مایتۆکۆندریای مرۆڤەوە جەختی لەسەر دەکرێتەوە. زۆربەی ئەم نەخۆشیانە بەهۆی گۆڕانی جینەکانەوە دروست دەبن کە دەربڕینی جینی مایتۆکۆندریال ڕێکدەخەن (1، 2) یان لەناوچوونی جینەکانی پەیوەست بە داینامیکی مایتۆکۆندریال، کە بە شێوەیەکی ناڕاستەوخۆ کاریگەرییان لەسەر سەقامگیری DNAی مایتۆکۆندریال (mtDNA) هەیە (3، 4). کارکردن لە مۆدێلی ئاژەڵەکاندا دەریخستووە کە لە وەڵامی تێکچوونی کارکردنی مایتۆکۆندریال لە شانەکانی دەوروبەردا، دەتوانرێت ڕێڕەوی گۆڕانکاری کۆنەپەرستانە (5-7) چالاک بکرێت، کە زانیاری گرنگ دەدات بۆ تێگەیشتنێکی قووڵ لە دروستبوونی نەخۆشی ئەم نەخۆشییە ئاڵۆزانە. لە بەرامبەردا، تێگەیشتنمان لە گۆڕانکارییەکانی میتابۆلیکی جۆرە تایبەتەکانی خانە کە بەهۆی شکستی گشتی بەرهەمهێنانی ئەدینۆسین ترای فۆسفات (ATP)ی مایتۆکۆندریاڵی مێشکەوە دروست دەبێت، بنەڕەتییە (8)، جەخت لەسەر پێویستی دەستنیشانکردنی ئامانجە چارەسەرییەکان دەکاتەوە کە دەتوانرێت بۆ ڕێگریکردن یان ڕێگریکردن لە نەخۆشی بەکاربهێنرێت. ڕێگریکردن لە تێکچوونی دەمارەکان (9). کەمی زانیاری ئەو ڕاستییەیە کە خانە دەمارییەکان بە شێوەیەکی بەرفراوان بە نەرمی گۆڕانکاری زۆر سنووردار دادەنرێت بە بەراورد بە جۆرەکانی خانەکانی شانەکانی دەوروبەر (10). بە سەرنجدان بەوەی کە ئەم خانانە ڕۆڵێکی سەرەکی دەگێڕن لە هەماهەنگیکردنی دابینکردنی میتابۆلیتەکان بۆ دەمارەکان بۆ پێشخستنی گواستنەوەی سیناپتیک و وەڵامدانەوەی بارودۆخی برینداربوون و نەخۆشی، توانای گونجاندنی میتابۆلیزمی خانەکان لەگەڵ بارودۆخە چالاکەکانی شانەکانی مێشک نزیکەی سنووردارە بە خانەکانی گلیال (11-14). سەرەڕای ئەوە، نایەکسانی خانەیی سروشتی شانەکانی مێشک تا ڕادەیەکی زۆر ڕێگری دەکات لە لێکۆڵینەوە لە گۆڕانکارییەکانی گۆڕانکاری خۆراک کە لە ژێر گروپە دەمارییە تایبەتەکاندا ڕوودەدەن. لە ئەنجامدا، زانیارییەکی کەم لەبارەی دەرئەنجامە خانەیی و گۆڕانکارییە وردەکانی تێکچوونی کارکردنی مایتۆکۆندریال لە دەمارەکاندا هەیە.
بۆ ئەوەی لە دەرئەنجامە گۆڕانکارییەکانی تێکچوونی کارکردنی مایتۆکۆندریال تێبگەین، ئێمە دەمارەکانی پورکینجی (PNs)مان جیاکردەوە لە قۆناغە جیاوازەکانی تێکچوونی دەمارەکاندا کە بەهۆی لەناوچوونی یەکگرتنی پەردەی دەرەوەی مایتۆکۆندریال (Mfn2)ەوە دروست بووە. هەرچەندە گۆڕانکارییەکانی Mfn2 لە مرۆڤدا پەیوەندییان بە جۆرێک لە نەخۆشی دەماری هەستیاری جووڵەیی بۆماوەییەوە هەیە کە بە جۆری 2Aی چارکۆت-ماری-ددان ناسراوە (15)، بەڵام لەناوچوونی مەرجداری Mfn2 لە مشکدا شێوازێکی ناتەواوی ئۆکساندنە کە بە باشی ناسراوە. ژێر جۆرە جیاوازەکانی دەمارەکان (16-19) و فینۆتایپی تێکچوونی دەمارەکانی دەرئەنجامی نیشانە دەمارییە پێشکەوتووەکانی لەگەڵدایە، وەک تێکچوونی جووڵە (18، 19) یان ئاتاکسیای مێشکچک (16). بە بەکارهێنانی تێکەڵەیەک لە پرۆتۆئۆمیکی چەندایەتی بێ لیبێڵ (LFQ)، میتابۆلۆمیک، وێنەگرتن، و شێوازەکانی ڤایرۆسۆلۆژی، ئێمە نیشان دەدەین کە تێکچوونی دەمارە پێشکەوتووەکان بە توندی هاندەری پیرۆڤات کاربۆکسیلاز (PCx) و هۆکارەکانی دیکەیە کە بەشدارن لە ڕەقبوونی خوێنبەرەکانی PNs لە ناو جەستەدا دەربڕینی ئەنزیمەکان. بۆ پشتڕاستکردنەوەی پەیوەندی ئەم دۆزینەوە، ئێمە بە تایبەتی دەربڕینی PCxمان لە PN کەمیی Mfn2 دابەزاند، و بۆمان دەرکەوت کە ئەم نەشتەرگەرییە فشاری ئۆکسجینی توندتر دەکات و تێکچوونی دەمارەکان خێراتر دەکات، بەم شێوەیە سەلماندی کە ئازۆسپێرمیا مردنی خانەکان دەبەخشێت گونجانی میتابۆلیکی. دەربڕینی توندی MFN2 دەتوانێت بە تەواوی PNی تێکچوونی کۆتایی ڕزگار بکات لەگەڵ کەمی توندی OXPHOS، بەکارهێنانی بەرفراوانی DNAی مایتۆکۆندریال، و تۆڕی مایتۆکۆندریال کە بەڕواڵەت شکاوە، کە زیاتر جەخت لەوە دەکاتەوە کە ئەم فۆرمەی تێکچوونی دەمارەکان تەنانەت دەتوانێت لە قۆناغی پێشکەوتووی نەخۆشییەکە پێش مردنی خانەکان چاکبێتەوە.
بۆ ئەوەی مایتۆکۆندریای لە Mfn2 knockout PNs ببینین، ئێمە جۆرێکی مشکمان بەکارهێنا کە ڕێگە بە مایتۆکۆندریای وابەستە بە Cre دەدات دەربڕینی پڕۆتینی فلۆرۆسەنتی زەرد (YFP) (mtYFP) (20) Cre بکەنە ئامانج و مۆرفۆلۆژیای مایتۆکۆندریالەکانمان لە ناو جەستەدا پشکنی. ئێمە بۆمان دەرکەوت کە لەناوچوونی جینی Mfn2 لە PNەکاندا دەبێتە هۆی دابەشبوونی وردە وردەی تۆڕی مایتۆکۆندریال (شێوەی S1A)، و زووترین گۆڕانکاری لە تەمەنی 3 هەفتەدا دۆزرایەوە. لە بەرامبەردا، تێکچوونی بەرچاوی چینە خانەی PN، وەک لە لەدەستدانی ڕەنگکردنی بەرگری کالبیندیندا دەردەکەوێت، تا تەمەنی 12 هەفتە دەستیپێنەکرد (شێوەی 1، A و B). ناتەبایی کات لە نێوان سەرەتاییترین گۆڕانکارییەکانی مۆرفۆلۆژی مایتۆکۆندریال و دەستپێکردنی بینراوی مردنی دەمارەکان وای لێکردین لێکۆڵینەوە لەو گۆڕانکارییە میتابۆلیزمانە بکەین کە بەهۆی تێکچوونی کارکردنی مایتۆکۆندریالەوە پێش مردنی خانەکان دەستپێدەکەن. ئێمە ستراتیژییەکی بنەمادار بە ڕیزکردنی خانە چالاککراوەکانی فلۆرۆسەنس (FACS)مان پەرەپێدا بۆ جیاکردنەوەی PNی دەربڕینی YFP (YFP+) (شێوەی 1C)، و لە مشکی کۆنترۆڵدا (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre)، کە لەمەودوا بە CTRL ناودەبرێت (شێوەی S1B). باشکردنی ستراتیژی دەروازەکردن لەسەر بنەمای چڕی ڕێژەیی سیگناڵی YFP ڕێگەمان پێدەدات جەستەی YFP+ (YFPhigh)ی PNs لە نا-PNs (YFPneg) پاک بکەینەوە (شێوەی S1B) یان پارچەی ئەکسۆن/دێندریتی فلۆرۆسەنت گوماناوی (YFPlow؛ وێنەی S1D، چەپ)، کە بە مایکرۆسکۆپی کۆنفۆکاڵی پشتڕاستکراوەتەوە (شێوەی S1D، ڕاست). بۆ ئەوەی ناسنامەی دانیشتوانی پۆلێنکراو پشتڕاست بکەینەوە، ئێمە پرۆتۆمیکی LFQ و پاشان شیکاری پێکهاتەی سەرەکیمان ئەنجامدا، و بۆمان دەرکەوت کە جیابوونەوەیەکی ڕوون لە نێوان خانەکانی YFPhigh و YFPneg هەیە (شێوەی S1C). خانەکانی YFPhigh دەوڵەمەندبوونی تۆڕی نیشاندەری PNs ناسراویان نیشان دا (واتە Calb1، Pcp2، Grid2 و Itpr3) (21، 22)، بەڵام هیچ دەوڵەمەندبوونێکی پڕۆتینەکانیان نیشان نەدا کە بە شێوەیەکی باو لە دەمارەکان یان جۆرەکانی تری خانەدا دەربڕدراون (شێوەی 1D)). بەراوردکردنێک لە نێوان نمونەکان لە خانە پۆلێنکراوەکانی YFPhigh کە لە تاقیکردنەوە سەربەخۆکاندا کۆکراونەتەوە ڕێژەی پەیوەندی> 0.9ی نیشان دا، کە توانای دووبارەبوونەوەی باشی لە نێوان دووبارەبوونەوەی بایۆلۆژیدا نیشان دەدات (شێوەی S1E). بە کورتی، ئەم زانیاریانە پلانەکەمانیان بۆ جیاکردنەوەی توند و تایبەتی PNی جێبەجێکراو پشتڕاستکردەوە. لەبەر ئەوەی سیستەمی شۆفێری L7-cre بەکارهێنراو هاندەری پێکەوەگرتنەوەی مۆزایک دەبێت لە هەفتەی یەکەمی دوای منداڵبوون (23)، ئێمە دەستمان کرد بە کوشتنی مشکەکان لە CTRL و مەرجدار (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) دەمارەکان کۆبکەینەوە. دوای تەواوبوونی پێکەوەگرێدانەوە، لە تەمەنی ٤ هەفتەدا پێی دەوترێت Mfn2cKO. وەک خاڵی کۆتایی، ئێمە تەمەنی 8 هەفتەمان هەڵبژارد کاتێک چینەکەی PN وەک خۆی بوو سەرەڕای پارچەبوونی ئاشکرای مایتۆکۆندریال (شێوەی 1B و وێنەی S1A). بە گشتی، ئێمە کۆی گشتی 3013 پڕۆتینمان ژمارەیی کرد، کە نزیکەی 22%یان لەسەر بنەمای تێبینییەکانی میتۆکارتا 2.0 بوو لەسەر بنەمای پرۆتۆئۆمی مایتۆکۆندریال وەک مایتۆکۆندریای (شێوەی 1E) (شێوەی 1E) (24). شیکاری دەربڕینی جینی جیاواز کە لە هەفتەی ٨ ئەنجامدرا دەریخست کە تەنها 10.5%ی هەموو پڕۆتینەکان گۆڕانکاری بەرچاویان هەبووە (شێوەی 1F و وێنەی S1F)، کە 195 پڕۆتینیان دابەزیوە و 120 پڕۆتین بەرەو سەرەوە ڕێکخراو بوون (شێوەی 1F). شایەنی باسە کە "شیکاری ڕێڕەوی داهێنەرانە"ی ئەم کۆمەڵە زانیارییە نیشان دەدات کە جینەکانی دەربڕینی جیاواز بە شێوەیەکی سەرەکی سەر بە کۆمەڵەیەکی سنووردار لە ڕێڕەوی گۆڕانکاری تایبەتن (شێوەی 1G). ئەوەی جێگای سەرنجە، هەرچەندە دابەزینی ڕێکخستنی ڕێڕەوەکانی پەیوەست بە OXPHOS و ئاماژەدانی کالیسیۆم هێنانەکایەی تێکچوونی کارکردنی مایتۆکۆندریال لە PN کەمیی یەکگرتن پشتڕاست دەکاتەوە، بەڵام پۆلەکانی تر کە بە شێوەیەکی سەرەکی میتابۆلیزمی ترشە ئەمینییەکان دەگرێتەوە بە شێوەیەکی بەرچاو بەرز دەکرێنەوە، کە ئەمەش هاوتەریبە لەگەڵ میتابۆلیزم کە لە میتۆکۆندریالەکاندا ڕوودەدات دووبارە وایەرکردن یەکدەگرێتەوە. تێکچوونی کارکردن.
(A) وێنەی کۆنفۆکاڵی نوێنەری بەشەکانی مێشکچکەی مشکەکانی CTRL و Mfn2cKO کە لەدەستدانی پێشکەوتووی PNs نیشان دەدەن (کالبیندین، خۆڵەمێشی); ناوکەکان بە DAPI دژە ڕەنگ کران. (B) ژماردن و دیاریکردنی (A) (شیکاری یەکلایەنەی جیاوازی، ***P<0.001؛ n = 4 بۆ 6 بازنە لە سێ مشکەوە). (ج) کاری تاقیکاری. (D) دابەشکردنی نەخشەی گەرمی نیشاندەرەکانی تایبەت بە پورکینجە (سەرەوە) و جۆرەکانی تری خانە (ناوەڕاست). (E) دیاگرامی ڤێن کە ژمارەی پڕۆتینەکانی مایتۆکۆندریال کە لە PN پۆلێنکراودا دەستنیشانکراون نیشان دەدات. (F) پڵۆتی گڕکانی پڕۆتینەکانی دەربڕینی جیاواز لە دەمارەکانی Mfn2cKO لە 8 هەفتەدا (بەهای بڕینی گرنگی 1.3). (G) شیکاری ڕێڕەوی داهێنان پێنج گرنگترین ڕێڕەوی ڕێکخستنی سەرەوە (سوور) و ڕێکخستنی خوارەوە (شین) لە Mfn2cKO PN کە وەک 8 هەفتە پۆلێنکراون نیشان دەدات. تێکڕای ئاستی دەربڕینی هەر پڕۆتینێکی دۆزراو نیشان دراوە. نەخشەی گەرمی خۆڵەمێشی: بەهای P ڕێکخراو. ns، گرنگ نییە.
داتاکانی پرۆتیۆمیکس دەریانخست کە دەربڕینی پڕۆتینی کۆمپلێکسەکانی I، III و IV وردە وردە کەمیکردووە. کۆمپلێکسەکانی I، III و IV هەموویان ژێر یەکە بنەڕەتییەکانی کۆدکراوی mtDNAیان تێدابوو، لە کاتێکدا کۆمپلێکسەکانی II کە تەنها کۆدکراوی ناوکی بوو، لە بنەڕەتدا کاریگەری نەبوو (شێوەی 2A و وێنەی S2A). . بەگوێرەی ئەنجامەکانی پرۆتۆمیکس، بەرگری بافتە کیمیاییەکانی بەشەکانی شانەکانی مێشکچک نیشانیدا کە ئاستی ژێر یەکەی MTCO1 (ژێر یەکەی ئۆکسیدایز سایتۆکرۆمی C ی مایتۆکۆندریال)ی کۆمپلێکسی IV لە PN وردە وردە کەمیکردووە (شێوەی 2B). ژێر یەکەی Mtatp8 کۆدکراوی mtDNA بە شێوەیەکی بەرچاو کەم بووەوە (شێوەی S2A)، لە کاتێکدا ئاستی دۆخی جێگیری ژێر یەکەی ATP synthase کۆدکراوی ناوکی وەک خۆی ماوەتەوە، کە لەگەڵ کۆمپلێکسی F1ی ژێرکۆبوونەوەی ATP synthase جێگیر ناسراودا یەکدەگرێتەوە کاتێک دەربڕینی mtDNA جێگیرە. پێکهاتنەکە یەکگرتووە. پچڕان (٧). هەڵسەنگاندنی ئاستی mtDNA لە Mfn2cKO PNs ڕیزکراوەکاندا بە کارلێکی زنجیرەیی پۆلیمیرازی کاتی ڕاستەقینە (qPCR) کەمبوونەوەی وردە وردەی ژمارەی کۆپی mtDNA پشتڕاستکردەوە. بە بەراورد لەگەڵ گروپی کۆنترۆڵ، لە تەمەنی 8 هەفتەدا، تەنها نزیکەی 20%ی ئاستی mtDNA هێڵدرایەوە (شێوەی 2C). بەگوێرەی ئەم ئەنجامانە، ڕەنگکردنی مایکرۆسکۆپی کۆنفۆکاڵی Mfn2cKO PNs بەکارهات بۆ دیاریکردنی DNA، کە بەکارهێنانی وابەستە بە کات لە نیوکلیۆتایدەکانی مایتۆکۆندریال نیشان دەدات (شێوەی 2D). ئێمە بۆمان دەرکەوت کە تەنها هەندێک لە کاندیدەکان کە بەشدارن لە تێکچوونی پڕۆتینی مایتۆکۆندریال و وەڵامی فشار بەرز ڕێکخراون، لەوانە Lonp1، Afg3l2 و Clpx، و هۆکارەکانی کۆبوونەوەی ئاڵۆزی OXPHOS. هیچ گۆڕانکارییەکی بەرچاو لە ئاستی پڕۆتینەکانی بەشدار لە ئەپۆپتۆزیدا دەستنیشان نەکرا (شێوەی S2B). بە هەمان شێوە، بۆمان دەرکەوت کە مایتۆکۆندریای و کەناڵەکانی تۆڕی ئەندۆپلازمی کە بەشدارن لە گواستنەوەی کالیسیۆم تەنها گۆڕانکاری بچووکیان هەیە (شێوەی S2C). سەرەڕای ئەوە، هەڵسەنگاندنی پڕۆتینەکانی پەیوەست بە ئۆتۆفاژی هیچ گۆڕانکارییەکی بەرچاوی نەدۆزیەوە، کە ئەمەش لەگەڵ هێنانەکایەی بینراوی ئۆتۆفاگۆزۆمەکاندا یەکدەگرێتەوە کە لە ناو جەستەدا بە بەرگری بافتە کیمیاییەکان و وردبینی ئەلکترۆنی بینراوە (شێوەی S3). بەڵام، تێکچوونی پێشکەوتووی ئۆکسفۆس لە PNەکاندا لەگەڵ گۆڕانکارییە دیارەکانی مایتۆکۆندریاڵی سەروو پێکهاتەییدایە. دەتوانرێت پۆلەکانی مایتۆکۆندریال لە جەستەی خانەکان و دارە دێندریتییەکانی Mfn2cKO PNs تەمەن 5 و 8 هەفتەدا ببینرێت، و پێکهاتەی پەردەی ناوەوە گۆڕانکاری قووڵی بەسەردا هاتووە (شێوەی S4، A و B). بەگوێرەی ئەم گۆڕانکارییە سەروو پێکهاتەیی و کەمبوونەوەی بەرچاو لە mtDNA، شیکاری پارچە توندەکانی مێشکی مێشک بە تێترامیتیلرۆدامین میتیل ئیستر (TMRM) دەریخست کە توانای پەردەی مایتۆکۆندریال لە Mfn2cKO PNs بە شێوەیەکی بەرچاو کەمیکردووە (شێوەی S4C).
(A) شیکاری کۆرسی کاتی ئاستی دەربڕینی کۆمپلێکسی OXPHOS. تەنها ئەو پڕۆتینانە لەبەرچاو بگرن کە P<0.05 یان هەیە لە 8 هەفتەدا (ANOVA دوولایەنە). هێڵی خاڵبەندی: هیچ ڕێکخستنێک نییە بە بەراورد بە CTRL. (B) چەپ: نموونەی بەشی مێشکچکە کە بە دژەتەنی دژە-MTCO1 ناوزەد کراوە (هێڵی پێوەر، 20 میکرۆمتر). ئەو ناوچەیەی کە جەستەی خانەکانی پورکینجە داگیری کردووە بە ڕەنگی زەرد داپۆشراوە. ڕاست: ژماردنی ئاستی MTCO1 (شیکاری یەکلایەنەی جیاوازی؛ n = 7 بۆ 20 خانە کە لە سێ مشکەوە شیکراونەتەوە). (C) شیکاری qPCR ژمارەی کۆپی mtDNA لە PN ڕیزکراودا (شیکاری یەکلایەنەی جیاوازی؛ n = 3 بۆ 7 مشک). (D) چەپ: نموونەی پارچەیەکی مێشکچک کە بە دژەتەنی دژە-DNA ناوزەد کراوە (پێوەر بار، 20 میکرۆمتر). ئەو ناوچەیەی کە جەستەی خانەکانی پورکینجە داگیری کردووە بە ڕەنگی زەرد داپۆشراوە. ڕاست: ژماردنی برینەکانی mtDNA (شیکاری یەکلایەنەی جیاوازی؛ n = 5 بۆ 9 خانە لە سێ مشک). (E) نموونەیەک لە بەشی توندی مێشکچکە کە خانەکانی mitoYFP + Purkinje نیشان دەدات (تیر) لە تۆمارکردنی گیرەی پەچەی تەواوی خانەدا. (F) ژماردنی کێوی IV. (G) تۆمارە نوێنەرایەتییەکانی دەرزی لێدانی جەمسەری لابردنی جەمسەری لە خانەکانی CTRL و Mfn2cKO Purkinje. شوێنپێی سەرەوە: یەکەم پەلسی کە AP ی دەستپێکرد. شوێنپێی خوارەوە: زۆرترین فرێکوێنسی AP. (H) ژماردنی زانیارییە خۆبەخۆکانی دوای سیناپتیک (sPSPs). شوێنپێی تۆمارکردنی نوێنەری و ڕێژەی زوومەکەی لە (I) دا نیشان دراوە. شیکاری یەکلایەنەی جیاوازی n = 5 بۆ 20 خانە لە سێ مشکەوە شیکردەوە. داتاکان بە شێوەی مامناوەندی±SEM دەربڕدراون؛ *P<0.05؛ **P<0.01؛ ***P<0.001. (J) شوێنەواری نوێنەری APی خۆبەخۆ تۆمارکراو بە بەکارهێنانی دۆخی گیرەی پەچەی کونکراو. شوێنپێی سەرەوە: زۆرترین فرێکوێنسی AP. شوێنپێی خوارەوە: زوومکردنی تاکە AP. (K) تێکڕای و زۆرترین فرێکوێنسی AP بەپێی (J) ژمارەیی بکە. تاقیکردنەوەی مان-ویتنی؛ n = 5 خانە لە چوار مشکەوە شیکرانەوە. داتاکان بە شێوەی مامناوەندی±SEM دەربڕدراون؛ گرنگ نییە.
تێکچوونی ئاشکرای OXPHOS لە Mfn2cKO PN ی تەمەن 8 هەفتەدا دۆزراوەتەوە، ئەمەش ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە ئەرکی فیزیۆلۆژی دەمارەکان بە توندی نائاساییە. بۆیە، ئێمە تایبەتمەندییە کارەباییە پاسیڤەکانی دەمارەکانی کەمی OXPHOSمان لە 4 بۆ 5 هەفتە و 7 بۆ 8 هەفتەدا شیکردەوە بە ئەنجامدانی تۆمارکردنی گیرەی پەچەی تەواوی خانەیی لە پارچە توندەکانی مێشکچکەدا (شێوەی 2E). بە شێوەیەکی چاوەڕواننەکراو، تێکڕای پۆتانسێلی پەردەی پشوودان و بەرگری هاتنە ژوورەوەی دەمارەکانی Mfn2cKO هاوشێوەی کۆنتڕۆڵ بوو، هەرچەندە جیاوازییەکی ورد لە نێوان خانەکاندا هەبوو (خشتەی 1). بە هەمان شێوە، لە تەمەنی 4 بۆ 5 هەفتەدا، هیچ گۆڕانکارییەکی بەرچاو لە پەیوەندییەکانی کارەبا-ڤۆڵتیە (کێوی IV)دا نەدۆزراوەتەوە (شێوەی 2F). بەڵام، هیچ دەمارێکی Mfn2cKO تەمەن 7 بۆ 8 هەفتە لە ڕێژیمی IV (هەنگاوی زیادە جەمسەرگیری) ڕزگاری نەبوو، ئەمەش ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە هەستیارییەکی ڕوون هەیە بۆ پۆتانسێلی زیادە جەمسەرگیری لەم قۆناغە درەنگەدا. لە بەرامبەردا، لە دەمارەکانی Mfn2cKO، جەمسەری لابردن کە دەبنە هۆی دەردانی پۆتانسێلی کرداری دووبارەبووەوە (AP) بە باشی بەرگە دەگیرێت، ئەمەش ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە شێوازی دەردانی گشتییان جیاوازییەکی بەرچاوی لەگەڵ دەمارە کۆنترۆڵکراوەکانی تەمەن 8 هەفتەدا نییە (خشتەی 1 و وێنەی 2G). بە هەمان شێوە، فرێکوێنسی و گەورەیی جەریانی دوای سیناپسی خۆبەخۆ (sPSCs) بەراورد دەکرا بە گروپی کۆنترۆڵ، و فرێکوێنسیی ڕووداوەکان لە 4 هەفتە بۆ 5 هەفتە بۆ 7 هەفتە بۆ 8 هەفتە زیاد بوو لەگەڵ زیادبوونی هاوشێوە (شێوەی 2، H و I). ماوەی پێگەیشتنی سیناپسی لە PNەکاندا (25). ئەنجامە هاوشێوەکان دوای پەچەی کونکراوی PNs بەدەست هات. ئەم پێکهاتەیە ڕێگری دەکات لە قەرەبووکردنەوەی ئەگەری کەموکوڕیەکانی ATP خانەیی، وەک ئەوەی لە تۆمارکردنی گیرەی پەچەی تەواوی خانەدا ڕووبدات. بە تایبەتی، پۆتانسێلی پەردەی پشوودان و فرێکوێنسیی تەقەکردنی خۆبەخۆی دەمارەکانی Mfn2cKO کاریگەری نەبووە (شێوەی 2، J و K). بە کورتی، ئەم ئەنجامانە ئاماژە بەوە دەکەن کە ئەو PNانەی کە تێکچوونی کارکردنی ئاشکرای OXPHOS یان هەیە دەتوانن بە باشی ڕووبەڕووی شێوازەکانی دەردانی فرێکوێنسی بەرز ببنەوە، ئەمەش ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە میکانیزمێکی قەرەبووکردنەوە هەیە کە ڕێگەیان پێدەدات وەڵامە ئەلکترۆفیزیۆلۆژییە نزیکەکان لە ئاسایی بپارێزن.
داتاکان بە شێوەی مامناوەندی ± SEM دەربڕدراون (شیکاری یەکلایەنەی جیاوازی، تاقیکردنەوەی بەراوردکاری فرەیی هۆڵم-سیداک؛ *P<0.05). ژمارەی یەکەکە بە کەوانە ئاماژەی پێکراوە.
ئێمە دەستمان کرد بە لێکۆڵینەوە لەوەی کە ئایا هەر پۆلێک لە کۆمەڵە داتاکانی پرۆتۆمیکسدا (شێوەی 1G) ڕێڕەوەکانی لەخۆگرتووە کە دەتوانێت بەرپەرچی کەمی توندی OXPHOS بداتەوە، بەمەش ڕوونی دەکەینەوە کە بۆچی PNی تووشبوو دەتوانێت ئەلکترۆفیزیۆلۆژیای نزیک لە ئاسایی بپارێزێت (شێوەی 2، E تا K). . شیکاری پرۆتۆمیکس دەریخست کە ئەنزیمەکانی بەشدار لە کاتابۆلیزمی ترشە ئەمینییە زنجیرە لقدارەکان (BCAA) بە شێوەیەکی بەرچاو بەرزکراونەتەوە (شێوەی 3A و وێنەی S5A)، و بەرهەمی کۆتایی ئەسیتیل-CoA (CoA) یان سوکسینیل CoA دەتوانێت تەواوکەری سێ کاربۆکسیلاتەکان بێت لە خولی ترشی ڕەقبوونی خوێنبەرەکان (TCA). بۆمان دەرکەوت کە ناوەڕۆکی BCAA transaminase 1 (BCAT1) و BCAT2 هەردووکیان زیاد بوون. ئەوان یەکەم هەنگاوی کاتابۆلیزمی BCAA کاتالیزە دەکەن بە دروستکردنی گلوتامات لە α-کیتۆگلوتارات (26). هەموو ئەو ژێر یەکانەی کە کۆمپلێکسی زنجیرەی لقدار کیتۆ ترشی دیهایدرۆجیناز (BCKD) پێکدەهێنن بەرەو سەرەوە ڕێکدەخرێن (کۆمپلێکسەکە کاتالیزەکردنی دیکاربۆکسیلاسیۆنی دواتر و نەگەڕاوەی ئێسکەپەیکەری کاربۆنی BCAAی دەرهاویشتوو) (شێوەی 3A و وێنەی S5A). بەڵام، هیچ گۆڕانکارییەکی دیار لە خودی BCAA لە PN ڕیزکراودا نەدۆزراوەتەوە، کە لەوانەیە بەهۆی زیادبوونی وەرگرتنی خانەیی ئەم ترشە ئەمینییە بنەڕەتییانە یان بەکارهێنانی سەرچاوەی دیکە (گلوکۆز یان ترشی لاکتیک) بۆ تەواوکردنی خولی TCA بێت (شێوەی S5B). هەروەها ئەو PNانەی کە OXPHOS یان نەبووە زیادبوونی شیبوونەوەی گلوتامین و چالاکییەکانی ترانزامیناسیۆنیان لە تەمەنی 8 هەفتەدا نیشان دا، کە دەتوانرێت بەهۆی بەرزبوونەوەی ڕێکخستنی ئەنزیمەکانی مایتۆکۆندریال گلوتامیناز (GLS) و گلوتامین پیرۆڤات ترانسئەمیناز ٢ (GPT2) ڕەنگ بداتەوە (شێوەی ٣، A و C). شایەنی باسە کە بەرزبوونەوەی ڕێکخستنی GLS سنووردارە بە ئایزۆفۆڕمی گلوتامیناز C (GLS-GAC)ی پەیوەستکراو (گۆڕینی Mfn2cKO/CTRL نزیکەی 4.5 هێندە، P = 0.05)، و بەرزبوونەوەی تایبەتی لە شانە شێرپەنجەییەکان دەتوانێت پشتگیری لە وزەی زیندەیی مایتۆکۆندریال بکات. (٢٧).
(A) نەخشەی گەرمی گۆڕانی تاودان لە ئاستی پڕۆتین بۆ ڕێگای دیاریکراو لە 8 هەفتەدا نیشان دەدات. (B) نموونەی پارچەیەکی مێشکچکە کە بە دژەتەنی دژە-PCx ناوزەد کراوە (پێوەر، 20 میکرۆمتر). تیرە زەردەکە ئاماژە بە جەستەی خانەی پورکینجە دەکات. (C) شیکاری دەربڕینی پڕۆتینی کۆرسی کات کە وەک کاندیدێکی گرنگ بۆ ڕەقبوونی خوێنبەرەکان دەستنیشانکرا (چەند تاقیکردنەوەی t، *FDR <5%؛ n = 3-5 مشک). (D) لە سەرەوە: دیاگرامێکی نەخشەیی کە ڕێگا جیاوازەکانی چوونە ژوورەوەی کاربۆنی نیشانەکراو کە لە شوێنپێهەڵگری [1-13C]پیرۆڤاتدا هەیە (واتە، لە ڕێگەی PDH یان ڕێگای ترانز-ئارتێریال) نیشان دەدات. خوارەوە: هێڵکاری کەمانچە ڕێژەی سەدی کاربۆنی تاکە نیشانەکراو (M1) نیشان دەدات کە گۆڕاوە بۆ ترشی ئەسپارتیک، ترشی لیمۆیی و ترشی مالیک پاش نیشانەکردنی پارچە توندەکانی مێشکچکە بە [1-13C]پیرۆڤات (تاقیکردنەوەی t جووت؛ ** P <0.01). (هـ) شیکاری مێژووی کاتیی گشتگیر بۆ ڕێڕەوی ئاماژەپێکراو. تەنها ئەو پڕۆتینانە لەبەرچاو بگرن کە P<0.05 یان هەیە لە 8 هەفتەدا. هێڵی خاڵی: هیچ بەهایەکی ڕێکخستن نییە (شیکاری دوولایەنەی جیاوازی؛ * P <0.05؛ *** P <0.001). داتاکان بە شێوەی مامناوەندی±SEM دەربڕدراون.
لە شیکارییەکەماندا، کاتابۆلیزمی BCAA بووەتە یەکێک لە ڕێڕەوی سەرەکی بەرزبوونەوەی ڕێکخستن. ئەم ڕاستییە بە توندی پێشنیاری ئەوە دەکات کە قەبارەی هەواگۆڕکێ کە دەچێتە ناو خولی TCA لەوانەیە لە PN کە OXPHOSی نییە بگۆڕدرێت. ئەمە ڕەنگە نوێنەرایەتی فۆرمێکی سەرەکی وایەرکردنی میتابۆلیکی دەمارەکان بکات، کە ڕەنگە کاریگەری ڕاستەوخۆی هەبێت لەسەر فیزیۆلۆژیای دەمارەکان و مانەوە لە کاتی پاراستنی تێکچوونی توندی ئۆکسفۆس. بەگوێرەی ئەم گریمانەیە، بۆمان دەرکەوت کە ئەنزیمە سەرەکییە دژە ڕەقبوونی خوێنبەرەکان PCx بەرز ڕێکخراوە (Mfn2cKO/CTRL نزیکەی 1.5 جار دەگۆڕێت؛ وێنەی 3A)، کە گۆڕینی پیرۆڤات بۆ ئۆکسالۆسیتات (28) کاتالیزە دەکات، کە پێدەچێت لە شانەکانی مێشکدا بێت دەربڕینەکە لە ئەستێرەخانەکاندا سنووردارە (29، 30). بەگوێرەی ئەنجامەکانی پرۆتۆمیکس، مایکرۆسکۆپی کۆنفۆکاڵی نیشانیدا کە دەربڕینی PCx بە شێوەیەکی تایبەت و بە شێوەیەکی بەرچاو زیاد بووە لە PNs کەمیی OXPHOS، لە کاتێکدا کارلێکی PCx بە شێوەیەکی سەرەکی سنووردار بووە بە خانە گلیالەکانی بێرگمان تەنیشت کۆنتڕۆڵەکە (شێوەی 3B). بۆ تاقیکردنەوەی کارایی بەرزبوونەوەی چاودێرکراوی PCx، ئێمە پارچەی توندی مێشکچکەمان بە [1-13C] شوێنپێهەڵگری پیرۆڤات چارەسەر کرد. کاتێک پیرۆڤات لەلایەن پیرۆڤات دیهایدرۆجیناز (PDH) ئۆکسجین کرا، ناوی ئایزۆتۆپەکەی نەما، بەڵام دەخرێتە ناو مامناوەندەکانی خولی TCA کاتێک پیرۆڤات بەهۆی کارلێکەکانی خوێنبەرەکانەوە میتابۆلیزە دەکرێت (شێوەی 3D). بۆ پشتگیریکردن لە داتاکانی پرۆتۆمیکسمان، ژمارەیەکی زۆر لە نیشاندەرەکانمان لەم شوێنپێهەڵگرەوە لە ترشی ئەسپارتیک لە پارچەکانی Mfn2cKOدا بەدیکرد، لە کاتێکدا ترشی لیمۆ و ترشی مالیکیش ڕەوتێکی مامناوەندیان هەبوو، هەرچەندە گرنگ نەبوو (شێوەی 3D).
لە دەمارە دۆپامینەکانی مشکەکانی میتۆپارک کە تێکچوونی کارکردنی مایتۆکۆندریالیان هەیە بەهۆی دەمارەکانی دۆپامین کە بە تایبەتی جینی فاکتەری نووسینەوەی مایتۆکۆندریال A (Tfam) لەناو دەبەن (شێوەی S6B)، دەربڕینی PCx بە شێوەیەکی بەرچاو بەرزبووەوە (31)، ئەمەش ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە ڕەقبوونی خوێنبەرەکانی ترشی ئەسیتۆن ڕوودانی نەخۆشییەکە لە کاتی تێکچوونی کارکردنی دەمارەکاندا ڕێکدەخرێت ئۆکسفۆس لە جەستەدا. شایەنی باسە کە دەرکەوتووە کە ئەنزیمە ناوازەکان (32-34) کە ڕەنگە لە دەمارەکاندا دەرببڕدرێن کە ڕەنگە پەیوەندییان بە ڕەقبوونی خوێنبەرەکانەوە هەبێت لە PNەکاندا کە لە OXPHOSدا نییە، وەکو پرۆپیۆنیل-CoA کاربۆکسیلاز (PCC-A)، مالۆنیل-CoA پرۆپیۆنیل-CoA دەگۆڕێت بۆ سوکسینیل-CoA و ئەنزیمەکانی مایتۆکۆندریال مالیک 3 (ME3)، کە ڕۆڵی سەرەکییان وەرگرتنەوەی پیرۆڤاتە لە مالات (شێوەی 3، A و C) (33، 35). سەرەڕای ئەوە، ئێمە زیادبوونی بەرچاومان لە ئەنزیمەکەی Pdk3 دۆزیەوە، کە فۆسفۆریلات دەکات و بەم شێوەیە PDH ناچالاک دەکات (36)، لەکاتێکدا هیچ گۆڕانکارییەک لە ئەنزیمەکەی Pdp1 کە PDH چالاک دەکات یان خودی کۆمپلێکسی ئەنزیمەکەی PDH دەستنیشان نەکرا (شێوەی 3A). بە بەردەوامی، لە Mern2cKO PNs، فۆسفۆڕیلاسیۆنی ژێر یەکەی α1 α (PDHE1α) ژێر یەکە لە پێکهاتەی پیرۆڤات دیهایدرۆجیناز E1ی کۆمپلێکسی PDH لە Ser293 (کە ناسراوە بە ڕێگریکردن لە چالاکیی ئەنزیمەکانی PDH) بەرزکرایەوە (شێوەی S6C) (شێوەی S6C). پیرۆڤات هیچ دەستڕاگەیشتنێکی بۆ خوێنبەرەکانی نییە.
لە کۆتاییدا، بۆمان دەرکەوت کە ڕێڕەوی سەرووی بایۆسێنتێزی سیرین و گلیسین، خولی پەیوەندیدار بە فۆلاتی مایتۆکۆندریال (1C) و بایۆسێنتێزی پرۆلین (شێوەی 1G و وێنەی S5C) هەموویان بە شێوەیەکی بەرچاو بەرز ڕێکخراون، بەپێی ڕاپۆرتەکان، لە کاتی پرۆسەی چالاککردندا. شانەکانی دەوروبەر بە تێکچوونی کارکردنی مایتۆکۆندریال چالاک دەبن (5-7). شیکاری کۆنفۆکاڵی پشتگیری لەم زانیارییە پرۆتۆئۆمیکانە دەریخست کە لە PN کە OXPHOS نەماوە، پارچە مێشکچکەکانی مشکی تەمەن 8 هەفتە خراونەتە ژێر سیرین هایدرۆکسی میتیل ترانسفێراس 2 (SHMT2)، ئەنزیمێکی سەرەکی خولی فۆلاتی مایتۆکۆندریال. وەڵامی بەرگری بەرچاو (شێوەی S5D). لە 13 پارچەی توندی مێشکچک کە بە CU-گلوکۆز کەرەوزکراون، تاقیکردنەوەکانی شوێنپێهەڵگرتنی گۆڕانکاری زیاتر بەرزبوونەوەی ڕێکخستنی بایۆسێنتێزی سیرین و پرۆلینیان پشتڕاستکردەوە، ئەمەش ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە شلەی ئایزۆفۆرمەکانی کاربۆن بۆ ناو سیرین و پرۆلین زیاد بووە (شێوەی S5E). بەو پێیەی کارلێکەکان کە لەلایەن GLS و GPT2ەوە بەرەوپێش دەچن بەرپرسن لە دروستکردنی گلوتامات لە گلوتامین و گواستنەوەی نێوان گلوتامات و α-کیتۆگلوتارات، بەرزبوونەوەی ڕێکخستنی ئەوان ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە دەمارەکانی کەمی OXPHOS داواکاری زیاتریان بۆ گلوتامات هەیە، ئەمە ڕەنگە ئامانجی پاراستنی زیادبوونی بایۆسێنتێزی پرۆلین بێت (شێوەی S5C). بە پێچەوانەی ئەم گۆڕانکاریانە، شیکارییەکی پرۆتۆئۆمیکی ئەستێرەخانە مێشکچکەکان لە مشکەکانی Mfn2cKO تایبەت بە PN دەریخست کە ئەم ڕێگایانە (لەوانەش هەموو دژە پەرۆکسیدایزەکان) گۆڕانکارییەکی بەرچاویان لە دەربڕیندا نەبووە، بەم شێوەیە نیشان دەدات کە ئەم ئاڕاستەکردنەوەی گۆڕانکارییە هەڵبژێردراوە بۆ PN تێکچوو (شێوەی S6، D بۆ G).
بە کورتی، ئەم شیکاریانە شێوازی جیاوازی بەرچاویان لە چالاککردنی کاتی ڕێڕەوی گۆڕانکاری تایبەت لە PNەکاندا ئاشکرا کرد. هەرچەندە کارکردنی نائاسایی مایتۆکۆندریاڵی دەمارەکان دەتوانێت ببێتە هۆی ڕەقبوونی خوێنبەرەکانی زوو و دووبارە داڕشتنەوەی 1C (شێوەی 3E و وێنەی S5C)، و تەنانەت گۆڕانکاری پێشبینیکراو لە دەربڕینی کۆمپلێکسەکانی I و IV، بەڵام گۆڕانکارییەکانی دروستکردنی سیرین دی نۆڤۆ تەنها تەنها لە قۆناغە درەنگەکاندا دەرکەوت. تێکچوونی کارکردنی OXPHOS (شێوەی 3E و وێنەی S5C). ئەم دۆزینەوانە پرۆسەیەکی یەک لە دوای یەک پێناسە دەکەن کە تیایدا مایتۆکۆندریال (خولی 1C) و سایتوبڵازمای (بایۆسێنتێزی سیرین) کە بەهۆی فشارەوە هێنراوەتەوە وەڵام دەدەنەوە بە شێوەیەکی هاوبەش لەگەڵ زیادبوونی ڕەقبوونی خوێنبەرەکان لە خولی TCA بۆ دووبارە داڕشتنەوەی میتابۆلیزمی دەمارەکان.
PNs 8 هەفتەیی کەمیی OXPHOS دەتوانن چالاکیی وروژاندنی فرێکوێنسی بەرز بپارێزن و دووبارە پەیوەندیکردنەوەی گۆڕانکاری بەرچاویان بەسەردا بێت بۆ قەرەبووکردنەوەی تێکچوونی کارکردنی مایتۆکۆندریال. ئەم دۆزینەوە ئەگەرێکی سەرنجڕاکێش دەوروژێنێت کە تەنانەت لەم ساتەدا، ئەم خانانە ڕەنگە دەستێوەردانی چارەسەری وەربگرن بۆ دواخستنی یان ڕێگریکردن لە تێکچوونی دەمارەکان. درەنگ. ئێمە ئەم ئەگەرەمان لە ڕێگەی دوو دەستێوەردانی سەربەخۆوە چارەسەر کرد. لە ڕێگەی یەکەمدا، ئێمە ڤێکتەرێکی ڤایرۆسی پەیوەست بە گرێی وابەستە بە Cre (AAV)مان دیزاین کرد بۆ ئەوەی MFN2 بتوانرێت بە شێوەیەکی هەڵبژێردراو لە PNs کەمیی OXPHOS لە ناو جەستەدا دەرببڕدرێت (شێوەی S7A). AAV کە MFN2 کۆد دەکات و جینی پەیامنێری فلۆرۆسەنت mCherry (Mfn2-AAV) لە کلتوری دەمارە سەرەتاییەکاندا لە ناو ئامێری پشکنیندا پشتڕاستکرایەوە، کە بووە هۆی ئەوەی MFN2 بە شێوەیەکی وابەستە بە Cre دەرببڕدرێت و مۆرفۆلۆژیای مایتۆکۆندریاڵی ڕزگارکرد، بەمەش ڕێگری لە گۆڕانی دەمارەکان دەکات لە دەمارەکانی Mfn2cKO (شێوەی S7، B، D و E). دواتر، ئێمە تاقیکردنەوەکانی ناو جەستەمان ئەنجامدا بۆ گەیاندنی ستێریۆتاکتیک Mfn2-AAVی تەمەن 8 هەفتەیی بۆ قۆڵۆنی مێشکچکەی Mfn2cKO و مشکی کۆنترۆڵ، و مشکی تەمەن 12 هەفتەمان شیکردەوە (شێوەی 4A). مشکە چارەسەرکراوەکانی Mfn2cKO مردن (شێوەی 1، A و B) (16). گواستنەوەی ڤایرۆسی لە ناو جەستەدا بووە هۆی دەربڕینی هەڵبژێردراوی PN لە هەندێک لە بازنەی مێشکچکدا (شێوەی S7، G و H). دەرزیکردنی AAVی کۆنترۆڵ کە تەنها mCherry (Ctrl-AAV) دەربڕیوە هیچ کاریگەرییەکی بەرچاوی لەسەر پلەی تێکچوونی دەمارەکان لە ئاژەڵەکانی Mfn2cKO نەبوو. لە بەرامبەردا، شیکاری Mfn2cKOs کە بە Mfn2-AAV گۆڕدراون کاریگەرییەکی پارێزەری بەرچاوی چینە خانەی PN نیشان دا (شێوەی 4، B و C). بە تایبەتی، پێدەچێت چڕی دەمارەکان نزیکەی جیا نەکرێتەوە لە ئاژەڵە کۆنترۆڵکراوەکان (شێوەی 4، B و C، و وێنەی S7، H و I). دەربڕینی MFN1 بەڵام MFN2 نا بە یەکسانی کاریگەرە لە ڕزگارکردنی مردنی دەمارەکان (شێوەی 4C و وێنەی S7، C و F)، ئەمەش ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە دەربڕینی MFN1ی دەرەوەی منداڵدان دەتوانێت بە شێوەیەکی کاریگەر تەواوکەری کەمی MFN2 بێت. شیکاری زیاتر لە ئاستی تاکە PN دەریخست کە Mfn2-AAV بە شێوەیەکی بەرچاو سەروو پێکهاتەی مایتۆکۆندریای ڕزگار کرد، ئاستی mtDNA ئاسایی کردۆتەوە، و دەربڕینی بەرزی نیشاندەری دژە-ئەنجیۆجینێسیس PCx پێچەوانە کردەوە (شێوەی 4، C بۆ E). پشکنینی بینراوی مشکە ڕزگارکراوەکانی Mfn2cKO لە دۆخی پشوودان دەریخست کە دۆخی جەستەیان و نیشانەکانی جووڵەیان (جووڵەی S1 بۆ S3) باشتر بووە. لە کۆتاییدا، ئەم تاقیکردنەوانە نیشان دەدەن کە دواکەوتنی دووبارە هێنانە ناوەوەی MFN2 بۆ ناو PNs کە کەمیی توندیان لە OXPHOS هەیە بەسە بۆ پێچەوانەکردنەوەی بەکارهێنانی mtDNA و هاندانی ڕەقبوونی خوێنبەرەکان، بەمەش ڕێگری لە تێکچوونی ئەکسۆنەکان و مردنی دەمارەکان دەکات لە ناو جەستەدا.
(A) پلانێک کە خشتەی تاقیکاری بۆ دەرزی لێدانی AAV کە MFN2 کۆد دەکات نیشان دەدات کاتێک ڕێڕەوی گۆڕانکارییەکانی ئاماژەپێکراو چالاک دەکرێت. (B) وێنەی کۆنفۆکاڵی نوێنەری پارچە مێشکچکەکانی تەمەن 12 هەفتە کە لە 8 هەفتەدا لە مشکی Mfn2cKO گۆڕدراون و بە دژەتەنی دژە-کالبیندین نیشانە کراون. ڕاست: پەستانی ڕیشاڵی ئەکسۆن. قەبارەی زوومی ئەکسۆن ٤٥٠ و ٧٥ میکرۆمترە. (C) چەپ: ژماردنی چڕی خانەکانی پورکینجە لە لوپی گواستنەوەی AAV (AAV+) (شیکاری یەکلایەنەی جیاوازی؛ n = 3 مشک). ڕاست: شیکاری فۆکۆسی mtDNA لە PN گۆڕاو لە هەفتەی 12 (تاقیکردنەوەی t جووت نەکراو؛ n = 6 خانە لە سێ مشک). * P <0.05؛ ** P <0.01. (D) وێنەی بچووکی ئەلکترۆنی گواستنەوەی نوێنەری PNەکانی بەشە مێشکچکەکانی Mfn2cKO کە بە ڤێکتەرە ڤایرۆسییە ئاماژەپێکراوەکان گۆڕدراون. ماسکی پەمەیی ئەو ناوچەیە نیشان دەدات کە دێندریتەکان داگیریان کردووە و چوارگۆشەی خاڵبەندی زەرد ئەو زوومە نیشان دەدات کە لە لای ڕاستەوە دابین کراوە؛ n نوێنەرایەتی ناوک دەکات. باری پێوەر، 1μm. (E) نموونەیەک لە ڕەنگکردنی PCx لە PN کە لە 12 هەفتەدا گۆڕدراوە نیشان دەدات. باری پێوەر، 20μm. OE، زیاد دەربڕین؛ FC، گۆڕینی تاودان.
لە کۆتاییدا، ئێمە لێکۆڵینەوەمان لە گرنگی مانەوەی خانەکانی هاندەری پەرۆکسیدایز کرد لە PNەکاندا کە تووشی تێکچوونی کارکردنی OXPHOS بوون. ئێمە mCherryمان دروستکرد کە کۆدکردنی AAV-shRNA (RNAی کورتی پەنجەی قژ) کە بە تایبەتی mRNAی PCxی مشک (AAV-shPCx)ی کردە ئامانج، و ڤایرۆسەکە یان کۆنتڕۆڵە تێکەڵاوەکەی (AAV-scr)مان دەرزی لێدا بۆ ناو مێشکی مشکەکانی Mfn2cKO. دەرزییەکە لە هەفتەی چوارەمی تەمەندا ئەنجامدرا (شێوەی 5A) بۆ بەدەستهێنانی کاریگەری PCx لە ماوەی ئەو ماوەیەی کە دەربڕینی PCx زیاد بوو (شێوەی 3C) و چینە خانەی PN هێشتا وەک خۆی بوو (شێوەی 1A). شایەنی باسە کە خستنە خوارەوەی PCx (شێوەی S8A) دەبێتە هۆی خێرابوونی بەرچاوی مردنی PN، کە سنووردارە بە ئەڵقەی تووشبوو (شێوەی 5، B و C). بۆ ئەوەی لە میکانیزمی کاریگەرییە گۆڕانکارییەکان تێبگەین کە بەهۆی بەرزبوونەوەی ڕێکخستنی PCxەوە هێنراونەتە ئاراوە، ئێمە لێکۆڵینەوەمان لە دۆخی ڕیدۆکسی PNs کرد دوای ئەوەی PCx کۆتایی پێهێنا و هەستەوەری زیندەیی بینایی Grx1-roGFP2 بە ناوەندگیری AAV لە یەک کاتدا دەربڕدرا (شێوەی S8، B بۆ D) بۆ هەڵسەنگاندنی گلوتاتیۆن گۆڕانی ڕێژەیی پۆتانسێلی ڕیدۆکسی پێپتید (38). پاشان، ئێمە مایکرۆسکۆپی وێنەگرتنی تەمەنی فلۆرۆسەنسی دوو فۆتۆنمان ئەنجامدا (FLIM) لە پارچە توندەکانی مێشکی 7 هەفتەیی Mfn2cKO یان هاوڕێ زبڵەکانی کۆنتڕۆڵ بۆ دیاریکردنی گۆڕانکارییە ئەگەرییەکان لە دۆخی ڕیدۆکسی سایتۆپلازمی دوای پشتڕاستکردنەوەی بارودۆخی FLIM (شێوەی S8، E بۆ G). شیکارییەکە زیادبوونی بەرچاوی لە دۆخی ئۆکساندنی تاکە Mfn2cKO PNs نیشان دا کە دەربڕینی PCxی نییە، کە جیاوازە لە دەمارە کۆنترۆڵکراوەکان یان Mfn2cKO PNs کە تەنها shRNA تێکەڵاو دەرئەبڕن (شێوەی 5، D و E). کاتێک دەربڕینی PCx دابەزیوە، ڕێژەی سەدی Mfn2cKO PNs کە دۆخێکی زۆر ئۆکسجینکراو نیشان دەدات زیاتر لە سێ هێندە زیادی کردووە (شێوەی 5E)، ئەمەش ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە بەرزبوونەوەی ڕێکخستنی PCx توانای ڕیدۆکسی دەمارە تێکچووەکانی پاراستووە.
(A) پلانێک کە خشتەی تاقیکاری بۆ دەرزی لێدانی AAV کە shPCx کۆد دەکات نیشان دەدات کاتێک ڕێڕەوی گۆڕانکارییەکانی ئاماژەپێکراو چالاک دەکرێت. (B) وێنەی کۆنفۆکاڵی نوێنەری بەشەکانی مێشکچکەی تەمەن 8 هەفتە لە مشکی Mfn2cKO کە گۆڕدراون و بە دژەتەنی دژە کالسینۆرین لە 4 هەفتەدا نیشانە کراون. باری پێوەر، 450μm. (C) ژماردنی چڕی خانەکانی پورکینجە لە لوپەکانی AAV-گۆڕدراودا (شیکاری یەکلایەنەی جیاوازی؛ n = 3 بۆ 4 مشک). داتاکان بە شێوەی مامناوەندی±SEM دەربڕدراون؛ ***P<0.001. (D) وێنەی نوێنەری FLIM تێکڕای تەمەنی PNی تەمەن 7 هەفتە نیشان دەدات کە هەستەوەری گلوتاتیون ڕیدۆکس Grx1-roGFP2 دەرئەبڕێت لە ژێر بارودۆخی تاقیکاری دیاریکراودا. ڕێژەی LUT (خشتەی سەیرکردن): ماوەی مانەوە (بە پیکۆ چرکە). باری پێوەر، 25μm. (E) هیستۆگرام دابەشبوونی بەهاکانی تەمەنی Grx1-roGFP2 لە (D)ەوە نیشان دەدات (n=158 بۆ 368 خانە لە دوو مشکدا لە ژێر هەر بارودۆخێکدا). هێڵکاری پای لە سەرووی هەر هیستۆگرامێکەوە: ژمارەی ئەو خانانە نیشان دەدات کە بەهای تەمەنیان بە شێوەیەکی بەرچاو درێژترە (سوور، ئۆکسجین) یان کورتتر (شین، کەمکراوە)، کە لە 1 SD لە بەهای تێکڕای تەمەن لە CTRL-AAV-scr زیاترە. (F) مۆدێلی پێشنیار کراو کاریگەری پارێزەری بەرزبوونەوەی PCx ی دەمارەکان نیشان دەدات.
بەگشتی، ئەو زانیاریانەی لێرەدا پێشکەشی دەکەین نیشان دەدەن کە دووبارە دەربڕینی MFN2 دەتوانێت بە تەواوی PN پێشکەوتوو ڕزگار بکات لەگەڵ کەمی توندی OXPHOS، کەمبوونەوەی توندی mtDNA، و مۆرفۆلۆژییەکی زۆر نائاسایی هاوشێوەی ista، بەمەش پێشکەوتنی بەردەوام تەنانەت لە نەخۆشییە پێشکەوتووەکاندا دابین دەکات. تێکچوونی دەمارەکان بەڵگەی گەڕاوەی قۆناغی پێش مردنی خانەکان دەدات. ئەم پلەیەی نەرمی گۆڕانکاری زیاتر جەختی لەسەر دەکرێتەوە بەهۆی توانای دەمارەکانەوە بۆ هاندانی ڕەقبوونی خوێنبەرەکان (تەواوکردنەوەیەکی خولی TCA)، کە دەربڕینی PCx لە PNەکاندا کە OXPHOSیان نییە ڕێگری دەکات و مردنی خانەکان بەرز دەکاتەوە، بەمەش ڕۆڵێکی پارێزەر دەگێڕێت (شێوەی 5F).
لەم لێکۆڵینەوەیەدا، ئێمە بەڵگەمان پێشکەش کرد کە وەڵامی PNs بۆ تێکچوونی کارکردنی OXPHOS ئەوەیە کە وردە وردە کۆببێتەوە بۆ ڕەقبوونی خوێنبەرەکانی خولی TCA لە ڕێگەی ڕێڕەوی چالاککردنی جیاوازەوە کە لەلایەن بەرنامەکانی گۆڕانکارییەوە چالاک دەکرێت. ئێمە شیکاری پرۆتۆئۆمیمان بە چەندین ڕێگەی تەواوکەر پشتڕاستکردەوە و دەرمانخست کە کاتێک بەهۆی تێکچوونی توندی مایتۆکۆندریالەوە تەحەدای دەکرێت، دەمارەکان فۆرمێکی پێشتر نەناسراوی لاستیکی گۆڕانکارییان هەیە. سەرمان سوڕما، مەرج نییە تەواوی پرۆسەی وایەرلێدان دۆخی گۆڕانکاری کۆتایی دیاری بکات کە وردە وردە و بە شێوەیەکی نەگەڕاوە هاوڕێی تێکچوونی دەمارەکانە، بەڵام داتاکانمان پێشنیاری ئەوە دەکەن کە ڕەنگە دەمارێکی پاراستن پێکبهێنێت تەنانەت لە قۆناغی پێش مردنی خانەکان میکانیزمی قەرەبووکردنەوەی کارایی. ئەم دۆزینەوە ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە دەمارەکان پلەیەکی بەرچاو لە پلاستیسیتی میتابۆلیزمیان لە جەستەدا هەیە. ئەم ڕاستییە دەیسەلمێنێت کە دواتر دووبارە هێنانەوەی MFN2 دەتوانێت دەربڕینی نیشاندەری سەرەکی گۆڕانکارییەکان پێچەوانە بکاتەوە و ڕێگری لە تێکچوونی PN بکات. بەپێچەوانەوە ڕێگری لە ڕەقبوونی خوێنبەرەکان دەکات و دەمارەکان خێراتر دەکات. ترانسسێکسوال.
یەکێک لە سەرنجڕاکێشترین دۆزینەوەکان لە لێکۆڵینەوەکانماندا ئەوەیە کە ئەو PNانەی کە OXPHOS یان نییە دەتوانن دەستکاری میتابۆلیزمی خولی TCA بکەن بە بەرزکردنەوەی ڕێکخستنی ئەنزیمەکان کە بە تایبەتی ڕەقبوونی خوێنبەرەکان هان دەدەن. ڕێکخستنەوەی میتابۆلیکی تایبەتمەندییەکی باوی خانە شێرپەنجەییەکانە، کە هەندێکیان پشت بە گلوتامین دەبەستن بۆ تەواوکردنی مامناوەندەکانی خولی TCA بۆ بەرهەمهێنانی هاوتای کەمکەرەوە، کە زنجیرەی هەناسەدان دەباتە پێشەوە و بەرهەمهێنانی پێشەکییەکانی بایۆسێنتێزی چەوری و نیوکلیۆتاید دەپارێزن (39، 40). توێژینەوەیەکی ئەم دواییە دەریخست کە لە شانە دەوروبەرییەکان کە تووشی تێکچوونی کارکردنی OXPHOS دەبن، دووبارە پەیوەستبوونەوەی میتابۆلیزمی گلوتامین/گلوتامات تایبەتمەندییەکی دیارە (5، 41)، کە ئاراستەی چوونە ژوورەوەی گلوتامین بۆ خولی TCA پەیوەستە بە بەهۆی توندی برینداربوونی OXPHOS (41). ). بەڵام بەڵگەی ڕوون نییە لەسەر هەر لێکچوونێکی پلاستیسیتی میتابۆلیکی دەمارەکان لە جەستەدا و ئەگەری پەیوەندییەکەی لە چوارچێوەی نەخۆشییەکەدا. لە توێژینەوەیەکی ئەم دواییەی ناو ئامێری پشکنیندا، دەمارە سەرەتاییەکانی قژ دەرکەوت کە حەوزەکانی گلوتامات بۆ گواستنەوەی دەمارەکان کۆدەکەنەوە، بەمەش میتابۆلیزمی ئۆکسجینی و ڕەقبوونی خوێنبەرەکان لە ژێر بارودۆخی فشاری گۆڕانکاریدا بەرەوپێش دەبەن (42). شایەنی باسە کە لە ژێر ڕێگری دەرمانناسیی ئەنزیمەکانی خولی TCA سوکسینات دیهایدرۆجیناز، پێدەچێت کاربۆکسیلاسیۆنی پیرۆڤات دروستکردنی ئۆکسالۆئەسیتات لە دەمارەکانی دانەوێڵەی مێشکچکەی کشتوکاڵیدا دەپارێزێت (34). بەڵام، پەیوەندی فیزیۆلۆژی ئەم میکانیزمانە بە شانەکانی مێشکەوە (کە پێدەچێت ڕەقبوونی خوێنبەرەکان بە شێوەیەکی سەرەکی لە ئەستێرەخانەکاندا قەتیس بێت) هێشتا گرنگییەکی فیزیۆلۆژی گرنگی هەیە (43). لەم حاڵەتەدا، زانیارییەکانمان نیشان دەدەن کە ئەو PNانەی کە بەهۆی OXPHOS لە جەستەدا زیانیان پێگەیشتووە دەتوانرێت بگۆڕدرێن بۆ تێکچوونی BCAA و کاربۆکسیلکردنی پیرۆڤات، کە دوو سەرچاوەی سەرەکی تەواوکەری ناوەندەکانی حەوزی TCAن. هەرچەندە بەشداری گوماناوی کاتابۆلیزمی BCAA لە میتابۆلیزمی وزەی دەمارەکاندا پێشنیار کراوە، بەڵام جگە لە ڕۆڵی گلوتامات و GABA بۆ گواستنەوەی دەمارەکان (44)، هێشتا هیچ بەڵگەیەک بۆ ئەم میکانیزمانە لە ناو جەستەدا نییە. بۆیە، ئاسانە گریمانە بکرێت کە PN ناکارامەکان دەتوانن بە شێوەیەکی ئۆتۆماتیکی قەرەبووی بەکارهێنانی ماددە ناوەندییەکانی TCA بکەنەوە کە بەهۆی پرۆسەی ئاسمیلەکردنەوە دەجوڵێن بە زیادکردنی ڕەقبوونی خوێنبەرەکان. بە تایبەتی، بەرزبوونەوەی ڕێکخستنی PCx ڕەنگە پێویست بێت بۆ پاراستنی زیادبوونی داواکاری بۆ ترشی ئەسپارتیک، کە پێشنیار دەکرێت لە خانە زیادبووەکاندا کە تێکچوونی کارکردنی مایتۆکۆندریالیان هەیە (45). بەڵام، شیکاری میتابۆلۆمیکی ئێمە هیچ گۆڕانکارییەکی بەرچاوی لە ئاستی دۆخی جێگیر لە ترشی ئەسپارتیک لە Mfn2cKO PNs ئاشکرا نەکرد (شێوەی S6A)، کە پێدەچێت ڕەنگدانەوەی بەکارهێنانی جیاوازی میتابۆلیکی ترشی ئەسپارتیک بێت لە نێوان خانە زیادبووەکان و دەمارەکانی دوای میتۆتیک. هەرچەندە میکانیزمی وردی بەرزبوونەوەی PCx لە دەمارە ناکارامەکاندا لە ناو جەستەدا ماوە تایبەتمەند بکرێت، بەڵام ئێمە نیشانمان دا کە ئەم وەڵامە پێشوەختەیە ڕۆڵێکی گرنگ دەگێڕێت لە پاراستنی دۆخی ڕیدۆکسی دەمارەکان، کە لە تاقیکردنەوەکانی FLIM لەسەر پارچە مێشکچکەکاندا دەرکەوت. بە تایبەتی، ڕێگریکردن لە PNs لە بەرزکردنەوەی ڕێکخستنی PCx دەتوانێت ببێتە هۆی دۆخی ئۆکسجینی زیاتر و خێراکردنی مردنی خانەکان. چالاککردنی تێکچوونی BCAA و کاربۆکسیلکردنی پیرۆڤات ڕێگەیەک نییە بۆ تایبەتمەندکردنی شانە دەوروبەرییەکانی تێکچوونی کارکردنی مایتۆکۆندریال (7). بۆیە پێدەچێت تایبەتمەندییەکی یەکەمایەتی دەمارەکانی کەمی ئۆکسفۆس بن، تەنانەت ئەگەر تاکە تایبەتمەندیش نەبن، کە گرنگە بۆ تێکچوونی دەمارەکان. .
نەخۆشی مێشکچکە جۆرێکی نایەکسانە لە نەخۆشی تێکچوونی دەمارەکان کە بەزۆری وەک ئاتاکسیا دەردەکەوێت و زۆرجار زیان بە PNەکان دەگەیەنێت (46). ئەم دانیشتووانەی دەمارەکان بە تایبەتی ئامادەن بۆ تێکچوونی کارکردنی مایتۆکۆندریال چونکە تێکچوونی هەڵبژێردراویان لە مشکدا بەسە بۆ دووبارە بەرهەمهێنانەوەی زۆرێک لە نیشانە جووڵاوەکان کە تایبەتمەندی ئاتاکسیای بڕبڕەی پشتی مێشکی مرۆڤن (16، 47، 48). بەپێی ڕاپۆرتەکان، مۆدێلێکی مشکی گۆڕدراوی جینی لەگەڵ جینێکی گۆڕاو پەیوەندی بە ئاتاکسیای سپینۆمێشکی مرۆڤەوە هەیە و تێکچوونی کارکردنی مایتۆکۆندریاڵی هەیە (49، 50)، ئەمەش جەخت لەسەر گرنگی لێکۆڵینەوە لە دەرئەنجامەکانی کەمی OXPHOS لە PNPH دەکاتەوە. بۆیە بە تایبەتی گونجاوە بۆ جیاکردنەوە و لێکۆڵینەوەی کاریگەرانە ئەم دانیشتووە ناوازەیەی دەمارەکان. بەڵام بە سەرنجدان بەوەی کە PNs زۆر هەستیارن بە فشار و بەشێکی کەم لە تەواوی دانیشتوانی خانەکانی مێشکچک پێکدەهێنن، بۆ زۆرێک لە توێژینەوەکانی بنەمای ئۆمیک، جیاکردنەوەی هەڵبژێردراویان وەک خانە تەواوەکان هێشتا لایەنێکی چالاکە. هەرچەندە نزیکە لە مەحاڵەوە کە کەمی ڕەهای پیسبوونی جۆرەکانی تری خانەکان بەدەست بهێنین (بەتایبەت شانە گەورەکان)، ئێمە هەنگاوێکی جیاکردنەوەی کاریگەرمان لەگەڵ FACS تێکەڵ کرد بۆ بەدەستهێنانی ژمارەیەکی پێویست لە دەمارە زیندووەکان بۆ شیکاری پرۆتۆمیکی خوارەوە، و ڕووپۆشکردنی پڕۆتینی زۆر بەرزمان هەیە (نزیکەی 3000 پڕۆتین) بە بەراورد لەگەڵ کۆمەڵە زانیارییە هەبووەکانی تەواوی مێشکچکە (51). بە پاراستنی توانای زیندوویی خانە تەواوەکان، ئەو ڕێگایەی لێرەدا پێشکەشی دەکەین ڕێگەمان پێدەدات نەک تەنها گۆڕانکارییەکانی ڕێڕەوی گۆڕانکاری لە مایتۆکۆندریایەکاندا بپشکنین، بەڵکو گۆڕانکارییەکانی هاوتا سایتۆپلازمیەکانیش بپشکنین، کە تەواوکەری بەکارهێنانی تاگی پەردەی مایتۆکۆندریال بۆ دەوڵەمەندکردنی جۆری خانەکان شێوازی نوێ بۆ ژمارەی مایتۆکۆندریای لە شانە ئاڵۆزەکاندا (52، 53). ئەو شێوازەی ئێمە باسی دەکەین تەنها پەیوەندی بە لێکۆڵینەوە لە خانەکانی پورکینجەوە نییە، بەڵکو دەتوانرێت بە ئاسانی بۆ هەر جۆرە خانەیەک بەکاربهێنرێت بۆ چارەسەرکردنی گۆڕانکارییەکانی میتابۆلیزم لە مێشکی نەخۆشدا، لەنێویاندا مۆدێلەکانی تری تێکچوونی کارکردنی مایتۆکۆندریال.
لە کۆتاییدا، ئێمە پەنجەرەیەکی چارەسەریمان دەستنیشان کردووە لەم پرۆسەی ڕێکخستنەوەی گۆڕانکاریدا کە دەتوانێت نیشانە سەرەکییەکانی فشاری خانەیی بە تەواوی پێچەوانە بکاتەوە و ڕێگری لە تێکچوونی دەمارەکان بکات. بۆیە، تێگەیشتن لە کاریگەرییە کاراییەکانی وایەرکردن کە لێرەدا باسکراوە، ڕەنگە تێڕوانینێکی بنەڕەتی بۆ چارەسەرە ئەگەرییەکان بۆ پاراستنی توانای زیندوویی دەمارەکان لە کاتی تێکچوونی کارکردنی مایتۆکۆندریالەکاندا دابین بکات. توێژینەوەکانی داهاتوو بە ئامانجی پارچەکردنی گۆڕانکارییەکانی میتابۆلیزمی وزە لە جۆرەکانی تری خانەکانی مێشکدا پێویستە بۆ ئەوەی بە تەواوی کارپێکردنی ئەم بنەمایە بۆ نەخۆشییە دەمارییەکانی تر ئاشکرا بکات.
مشکەکانی میتۆپارک پێشتر باسکراون (31). مشکی C57BL/6N کە جینەکانی Mfn2ی لایەنی loxP یان هەیە پێشتر باسکراون (18) و لەگەڵ مشکی L7-Cre یەکتریان بەستراوەتەوە (23). پاشان نەوە دوو هێتەرۆزایگۆسەکانی دەرەنجامی لەگەڵ مشکی هاوزایگۆسی Mfn2loxP/Mfn2loxP بەستران بۆ دروستکردنی کۆتایی جینی تایبەت بە Purkinje بۆ Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP؛ L7-cre). لە ژێرکۆمەڵەیەکی جووتبووندا، ئالێلی Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) لە ڕێگەی بڕینی زیادەوە ناسێندرا (20). هەموو ڕێکارەکانی ئاژەڵ بەپێی ڕێنماییە ئەوروپی و نیشتمانی و دامەزراوەییەکان ئەنجامدراون و لەلایەن LandesamtfürNatur لە Umwelt و Verbraucherschutz، North Rhine-Westphalia، ئەڵمانیا پەسەندکراون. هەروەها کاری ئاژەڵان بە ڕێنمایی فیدراسیۆنی ئەوروپی کۆمەڵەکانی زانستە ئاژەڵییەکانی تاقیگەیی پەیڕەو دەکات.
دوای بێهۆشکردنی شلبوونەوەی ملی ڕەحمی ژنە دووگیانەکە، کۆرپەی مشکەکە جیا دەکرێتەوە (E13). قۆڵۆنەکە لە گیراوەی خوێی هاوسەنگ (HBSS)ی هانکس کە بە 10 میلی مۆلی هێپێس تەواوکرابوو پارچە پارچە کرا و گواسترایەوە بەسەر ناوەندی هەڵۆی دەستکاریکراوی دولبێکۆ کە پاپاین (20 U/ml) و سیستئین (1μg/ml)ی تێدابوو. شانەکە لە DMEM) کەرەوز بکە و بە هەرسکردنی ئەنزیمی جیای بکەرەوە. Ml) لە پلەی گەرمی 37 پلەی سەدی بۆ ماوەی 20 خولەک، و پاشان بە شێوەیەکی میکانیکی لە DMEM کە بە سیرۆمی کۆرپەی گا 10% تەواوکراوە، ورد دەکرێت. خانەکان لەسەر شلەی ڕووپۆشی شووشەیی کە بە پۆلیلیسین ڕوپۆش کرابوون بە چڕی 2×106 بۆ هەر قاپێکی کشتوکاڵی 6 سم یان بە چڕی 0.5×105 خانە/سم2 بۆ شیکاری وێنەگرتن تۆو کران. دوای 4 کاتژمێر، ناوەندەکە بە ناوەندێکی بێ سیرۆمی Neurobasal گۆڕدرا کە 1% تەواوکەری B27 و 0.5 mM GlutaMax ی تێدابوو. پاشان دەمارەکان لە پلەی گەرمی 37 پلەی سەدی و 5% CO2 بە درێژایی تاقیکردنەوەکە ڕاگیران، و هەفتەی جارێک خۆراکیان پێدرا. بۆ ئەوەی هاندانی پێکەوەگرێدانەوە لە ناو ئامێری پشکنیندا، 3 میکرۆلیتر (قاپی کشتوکاڵی 24 چاڵ) یان 0.5 میکرۆلیتر (پلێتی 24 چاڵ) لەم ڤێکتەرەی خوارەوەی ڤایرۆسی AAV9 بەکارهێنرا بۆ چارەسەرکردنی دەمارەکان لە ڕۆژی دووەم لە ناو ئامێری پشکنیندا: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene، ژمارەی کەتەلۆگ 105530-AAV9) و AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene، ژمارەی کەتەلۆگ 105545-AAV9).
DNAی تەواوکەری مشک Mfn1 و Mfn2 (کە لە پلازمیدی Addgene #23212 و #23213 بەدەست هاتووە، بە ڕێککەوت) بە زنجیرەی V5 (GKPIPNPLLGLDST) لە کۆتایی C نیشانە کراون، و لەگەڵ mCherry لە چوارچێوەدا لە ڕێگەی زنجیرەی T2A تێکەڵ دەکرێن. Grx1-roGFP2 دیارییەکە لەلایەن هایدلبێرگ تی پی دیک DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) ەوە. بە گۆڕینی کاسێتی tdTomato بە بەکارهێنانی ڕێگاکانی کلۆنکردنی ئاسایی، کاسێتەکە ژێر کلۆن کرا بۆ ناو بڕبڕەی پشتی pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (ژمارەی ئاماژەی زیادکراو 28306) بۆ دروستکردنی pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5، pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 و ڤێکتەرەکانی pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. ستراتیژییەکی هاوشێوە بۆ دروستکردنی ڤێکتەری کۆنترۆڵ pAAV-CAG-FLEX-mCherry بەکارهات. بۆ ئەوەی بنیاتنانی AAV-shPCx دروست بکرێت، ڤێکتەرێکی پلازمی AAV (VectorBuilder، pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) پێویستە، کە زنجیرەی DNA لەخۆدەگرێت کە کۆدی shRNA ی PCx مشکی ئامانج دەکات (5'CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) لە ژێر کۆنترۆڵی بەرزکەرەوەی U6، mCherry لە ژێر کۆنترۆڵی بەرزکەرەوەی CMV بەکاردەهێنرێت. بەرهەمهێنانی ڤێکتەری یارمەتیدەری AAV بەپێی ڕێنماییەکانی بەرهەمهێنەر (Cell Biolabs) ئەنجامدرا. بە کورتی، پلازمیدەیەکی گواستنەوە بەکاربهێنە کە هەڵگری mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5)، mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) بە شێوەیەکی کاتی گواستنەوەی 293AAV خانەکان-T2A-MFN1-V5)، mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) یان Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) جینی کۆدکردن، هەروەها کۆدکردنی پڕۆتینی کاپسیدی AAV1 و پڕۆتینی یارمەتیدەر پلازمیدی پلازمی پاکەتکردن، بە بەکارهێنانی ڕێگەی فۆسفاتی کالیسیۆم. شلەی سەرەوەی ڤایرۆسی خاو بە خولەکانی بەستن-توانەوە لە حەمامێکی سەهۆڵی وشک/ئیتانۆل و خانە لایزەکراوەکان لە خوێی فۆسفات بافەرکراو (PBS) بەدەست هات. ڤێکتەری AAV بە ڕێگەی نابەردەوامی یۆدیکسانۆڵ گرادێنت ئۆڵتراسەنتەرفۆجکردن پاککرایەوە (24 کاتژمێر لە 32,000 خولەک لە خولەکێکدا و 4 پلەی سەدی) و بە بەکارهێنانی فلتەری سەنتەرفۆگالی ئەمیکۆن ئۆڵترا-15 چڕکرایەوە. تایتەری جینۆمی AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 کۆپی جینۆمی (GC)/ml]، AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml)، AAV1-CAG- FLEX وەک پێشتر باسکراوە بوو (54)، بە PCRی چەندایەتی کاتی ڕاستەقینە (qPCR) پێوانە کرا -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) و AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
دەمارە سەرەتاییەکان لە 1x PBSی سارد و سەهۆڵاویدا ڕشێنران، گوللەیان لێکرا، و پاشان لە 0.5% تریتۆن ئێکس-100 / 0.5% سۆدیۆم دیۆکسیکۆلات/PBS لایزی بافەر کە فۆسفاتاز و ڕێگریکەری پرۆتئازی تێدایە (Roche) یەکسان کران. ژماردنی پڕۆتینەکان بە بەکارهێنانی تاقیکردنەوەی ترشی بیسینکۆنینیک (Thermo Fisher Scientific) ئەنجامدرا. پاشان پڕۆتینەکان بە ئەلکترۆفۆڕێزی جێڵی SDS-polyacrylamide جیاکرانەوە، و پاشان بلۆت کران لەسەر پەردەی پۆلیڤینیلیدین فلۆراید (GE Healthcare). شوێنە نادیاریکراوەکان بلۆک بکە و لەگەڵ دژەتەنی سەرەتایی (بۆ وردەکارییەکان سەیری خشتەی S1 بکە) لە شیری 5% لە TBST (خوێی تریس-بافەر لەگەڵ Tween)، هەنگاوەکانی شۆردن و دژەتەنی لاوەکی لە TBST Incubate کەرەوز بکە. لەگەڵ دژەتەنی سەرەتایی بۆ ماوەی شەوێک لە پلەی گەرمی +4 پلەی سەدی کەرەوز بکە. دوای شۆردن، دژەتەنی لاوەکی بۆ ماوەی ٢ کاتژمێر لە پلەی گەرمی ژووردا بدە. دواتر، بە کەرەوزکردنی هەمان بلۆت لەگەڵ دژەتەنی دژە-β-ئەکتین، هەمان بارگاویکردنەوە پشتڕاستکرایەوە. دیاریکردن بە گۆڕینی بۆ کیمیایی ڕووناکی و بەرزکردنەوەی کیمیایی ڕووناکی (GE Healthcare).
ئەو دەمارانەی پێشتر لەسەر پۆشینی شووشە تۆو کراون بە 4% پارافۆرماڵدەهید (PFA)/PBS لە خاڵە کاتییە دیاریکراوەکاندا لە پلەی گەرمی ژووردا بۆ ماوەی 10 خولەک جێگیرکراون. سەرەتا کۆڤەرسلیپەکان بە 0.1% تریتۆن ئێکس-100/PBS بۆ ماوەی 5 خولەک لە پلەی گەرمی ژووردا، و پاشان لە بافەری بلۆککردندا [3% ئەلبومین سیرۆمی گا (BSA)/PBS] دەچنە ناوەوە. لە ڕۆژی دووەمدا، کۆڤەرسلیپەکان بە بافەری بلۆککردن شۆردران و لەگەڵ دژەتەنی لاوەکی گونجاوی فلۆرۆفۆر-کۆنجۆگەیتد بۆ ماوەی ٢ کاتژمێر لە پلەی گەرمی ژووردا کەرەوز کران؛ لە کۆتاییدا، نموونەکان بە باشی لە PBS شۆردران بە 4',6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) دژە ڕەنگ کراوە و پاشان لەسەر سلایدی مایکرۆسکۆپ بە Aqua-Poly/Mount جێگیر کراوە.
مشکەکان (نێر و مێ) بە دەرزی ناو زراو بە کیتامین (130 میلیگرام/کیلۆگرام) و زایلازین (10 میلیگرام/کیلۆگرام) بێهۆش کران و لە ژێر پێستدا بە ئازارشکێنی کارپڕۆفین (5 میلیگرام/کیلۆگرام) بەکارهێنران، و لە ئامێرێکی ستێریۆتاکتیک (Kopf) دانران کە پادێکی گەرمی تێدابوو. کەللەسەرەکە ئاشکرا بکە و دریلێکی ددان بەکاربهێنە بۆ تەنککردنەوەی ئەو بەشەی قۆڵۆنی مێشکچک کە هاوتایە لەگەڵ ئێسکی میس (لە لامبدا: کلکی 1.8، لایەنی 1، هاوتایە لەگەڵ لوولەکانی IV و V). دەرزییەکی سرنجی کێشراو بەکاربهێنە بۆ ئەوەی بە وریاییەوە کونێکی بچووک لە کەللەسەردا دروست بکەیت بۆ ئەوەی بۆرییەکانی خوارەوە تێک نەچێت. پاشان موولوولەکانی شووشەی تەنک کێشراو بە هێواشی دەخرێتە ناو کونە مایکرۆکە (لە -1.3 بۆ -1 لە لای سک لە دورا ماتەر)، و 200 بۆ 300 نl AAV بە دەرزی لێدەدرێتە ناو مایکرۆ-دەرزی (Narishige) بە سرنجی دەستی (Narishige) چەند جارێک بە پەستانی نزم لە ماوەی 10 بۆ 20 خولەک پەنجەرە. دوای ئینفیوژنەکە بۆ ماوەی ١٠ خولەکی تر موولوولەکە دابنێ بۆ ئەوەی ڤایرۆسەکە بە تەواوی بڵاوبێتەوە. دوای ئەوەی موولوولەکان دەکێشرێنەوە، پێستەکە بە وریاییەوە دەدوێنرێت بۆ ئەوەی کەمترین هەوکردنی برینەکە هەبێت و ڕێگە بدات ئاژەڵەکە چاکبێتەوە. ئاژەڵەکان بۆ چەند ڕۆژێک دوای نەشتەرگەرییەکە بە دەرمانی ئازارشکێن (کاسپۆفین) چارەسەر کران، لەو ماوەیەدا بە وردی چاودێری باری جەستەیییان کرا و دواتر لە خاڵە کاتییە دیاریکراوەکاندا کوژران. هەموو ڕێکارەکان بەپێی ڕێنماییە ئەوروپی و نیشتمانی و دامەزراوەییەکان ئەنجامدراون و لەلایەن LandesamtfürNatur لە Umwelt و Verbraucherschutz، North Rhine-Westphalia، ئەڵمانیا پەسەندکراون.
ئاژەڵەکان بە کیتامین (100 میلیگرام/کیلۆگرام) و زایلازین (10 میلیگرام/کیلۆگرام) بێهۆش کران، و دڵەکە سەرەتا بە 0.1 M PBS پەرفیوژ کرا، و پاشان بە 4% PFA لە PBS. شانەکە پارچە پارچە کرا و لە 4% PFA/PBS بۆ ماوەی شەوێک لە پلەی گەرمی 4°C جێگیرکرا. چەقۆیەکی لەرزین (Leica Microsystems GmbH، ڤیەنا، نەمسا) بەکارهات بۆ ئامادەکردنی بەشە ساجیتاڵەکان (ئەستووری 50 میکرۆمتر) لە مێشکی جێگیر لە PBS. مەگەر بە پێچەوانەوە دیاری نەکرێت، ڕەنگکردنی بەشە ئازادەکان وەک لە سەرەوە باسکراوە (13) لە پلەی گەرمی ژوور و تێکەڵکردن ئەنجامدرا. بە کورتی، سەرەتا، پارچە بەدەست هاتووەکان بە 0.5% تریتۆن ئێکس-100/PBS بۆ ماوەی 15 خولەک لە پلەی گەرمی ژووردا ڕژێنران؛ بۆ هەندێک لە ئێپیتوپەکان (Pcx و Shmt2)، لە بافەری tris-EDTA لە پلەی گەرمی 80 پلەی سەدی (PH 9) پارچەکان بۆ ماوەی 25 خولەک گەرم بکە لەبری ئەم هەنگاوە. دواتر، بەشەکان لەگەڵ دژەتەنی سەرەتایی (بڕوانە خشتەی S1) لە بافەری بلۆککردن (3% BSA/PBS) لە پلەی گەرمی 4°C بۆ ماوەی شەوێک لەگەڵ تێکەڵکردن کەرەوز کران. ڕۆژی دواتر، بەشەکان بە بافەری بلۆککردن شۆردران و لەگەڵ دژەتەنی لاوەکی گونجاوی فلۆرۆفۆر-کۆنجۆگەیتد بۆ ماوەی ٢ کاتژمێر لە پلەی گەرمی ژووردا کەرەوز کران؛ لە کۆتاییدا، بەشەکان بە باشی لە PBS شۆردران، بە DAPI ڕەنگکرانەوە، و پاشان بە AquaPolymount لەسەر سلایدی مایکرۆسکۆپ جێگیرکران.
مایکرۆسکۆپی کۆنفۆکاڵی سکانکردنی لەیزەر (TCS SP8-X یان TCS Digital Light Sheet، Leica Microsystems) کە بە لەیزەری ڕووناکی سپی و لەیزەری سەروو بنەوشەیی 405 دایۆد تەیار کراوە بۆ وێنەگرتنی نمونەکە بەکارهێنرا. بە وروژاندنی فلۆرۆفۆر و کۆکردنەوەی سیگناڵەکە بە هایبرید دیتێکتەر (HyDs)، نەرمەکاڵای LAS-X بەکارهات بۆ کۆکردنەوەی وێنەی کۆکراوە کە لەگەڵ نمونەگرتنی نایکویستدا دەگونجێت لە دۆخی یەک لە دوای یەکدا: بۆ پانێڵە ناچەندییەکان، ئەوە سیگناڵە زۆر دینامیکییەکانە (بۆ نموونە، لە خانە سۆماتیکییەکان و دێندریتەکاندا) mtYFP) HyD بەکاربهێنە بۆ دیاریکردنی ژمارەی PNەکان لە دۆخی BrightR). گەیتینگ لە 0.3 بۆ 6 ns بەکاردەهێنرێت بۆ کەمکردنەوەی پاشبنەما.
وێنەگرتنی کاتی ڕاستەقینەی خانە ڕیزکراوەکان. پاش ڕیزکردن لە ناوەندێکی Neurobasal-A کە 1% تەواوکەری B27 و 0.5 mM GlutaMax لەخۆدەگرێت، خانەکان دەستبەجێ لەسەر سلایدی شووشەی پۆلی-l-lysine-coated (μ-Slide8 Well، Ibidi، ژمارەی کەتەلۆگ 80826) تۆو کران، و پاشان لە پلەی گەرمی 37°C و 5% CO2 بۆ ماوەی 1 کاتژمێر ڕاگیرا بۆ ئەوەی خانەکان جێگیر ببن. وێنەگرتنی کاتی ڕاستەقینە لەسەر مایکرۆسکۆپی کۆنفۆکاڵی سکانکردنی لەیزەری Leica SP8 ئەنجامدرا کە بە لەیزەری سپی، HyD، 63×[1.4 دەرچەی ژمارەیی (NA)] عەدەسەی ئامانجی ڕۆن و قۆناغی گەرمکردنەوە تەیارکرابوو.
مشکەکە بە خێرایی بە دووەم ئۆکسیدی کاربۆن بێهۆش کرا و سەری بڕی، مێشکی بە خێرایی لە کەللەسەری دەرهێنرا، و بڕدرا بۆ بەشی 200 میکرۆمەتر ئەستووری (بۆ تاقیکردنەوەی نیشاندانی 13C) یان 275 میکرۆمەتر ئەستووری (بۆ دوو تاقیکردنەوەی فۆتۆن) بەشی ساجیتاڵ پڕکرا لەم مادانەی خوارەوە ئایسکرێمەکە (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) پڕ دەکرێتەوە بەم ماددانەی خوارەوە: 125 میلی مۆلی ساردی سەهۆڵی، تێرکراوی کاربۆن (95% O2 و 5% CO2) کەم Ca2 + شلەی دەستکردی مێشک و بڕبڕەی پشت (ACSF) NaCl، 2.5 میلی مۆلی KCl، 1.25 میلی مۆلی بافەری فۆسفاتی سۆدیۆم، 25 میلی مۆلی NaHCO3، 25 میلی مۆلی گلوکۆز، 0.5 میلی مۆلی CaCl2 و 3.5 میلی مۆلی MgCl2 (پەستانی گەرمی 310 بۆ 330 مۆل). پارچە مێشکی بەدەست هاتوو بگوازەرەوە بۆ ژوورێکی پێش کەرەوزکردن کە Ca2 + ACSF ی بەرزتری تێدایە (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM سۆدیۆم فۆسفات بافەر، 25.0 mM NaHCO3، 25.0 mM d-glucose، 1.0 mM CaCl2 و 2.0 mM MgCl2) مامناوەند) pH 7.4 و 310 بۆ 320 مۆل).
لە کاتی پرۆسەی وێنەگرتندا، پارچەکان گواسترانەوە بۆ ژوورێکی تایبەت بە وێنەگرتن، و تاقیکردنەوەکە لە ژێر پەرفیوژنی بەردەوامی ACSF لە پلەی گەرمی بەردەوامی 32° بۆ 33°C ئەنجامدرا. مایکرۆسکۆپی سکانکردنی لەیزەری فرە فۆتۆن (TCS SP8 MP-OPO، Leica Microsystems) کە بە عەدەسەی ئامانجی لایکا 25x (NA 0.95، ئاو)، لەیزەری Ti: Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) تەیار کراوە بۆ وێنەگرتنی پارچە بەکارهێنرا. مۆدیۆلی FLIM (PicoHarp300، PicoQuant).
FLIM ی Grx1-roGFP2. گۆڕانکارییەکانی دۆخی ڕیدۆکسی سایتوبڵازمای PNs بە دوو فۆتۆن FLIM لە پارچە مێشکی ساجیتاڵدا پێوانە کرا، کە تێیدا هەستەوەری زیندەیی Grx1-roGFP2 PNs ی کردە ئامانج. لە چینە PN دا، مەیدانی بەدەستهێنان نزیکەی 50 بۆ 80 میکرۆمتر لە خوار ڕووی پارچەکە هەڵدەبژێردرێت بۆ دڵنیابوون لەوەی کە PN ی زیندوو هەیە (واتە نەبوونی پێکهاتەی بڕبڕەدار یان گۆڕانکاری مۆرفۆلۆژی دەمارەکان بەدرێژایی دێندریتەکان) و هەستەوەری دوو پۆزەتیڤی roGFP2 و AAV کۆدکردنی shRNA PCx یان زنجیرەی کۆنترۆڵکردنی (هەر یەکێکیان هاودەربڕینی mCherry). کۆکردنەوەی وێنەی تاکە ستاک بە زوومی دیجیتاڵی 2x [درێژی شەپۆلی وروژاندن: 890 نانۆمەتر؛ 512 نانۆمەتر 512 پێکسڵ]. دیاریکردن: HyD ناوخۆیی، گروپی فلتەری فلۆرۆسێین ئایزۆتۆسیانات (FITC)] و مامناوەندیکردنی وێنە لە ماوەی 2 بۆ 3 خولەکدا بەکاردەهێنرێت بۆ دڵنیابوون لەوەی کە فۆتۆنی پێویست کۆدەکرێنەوە (1000 فۆتۆن بە گشتی) بۆ جێگیرکردنی کێشەکان. هەستیاری پشکنەری Grx1-roGFP2 و پشتڕاستکردنەوەی بارودۆخی FLIM بە چاودێریکردنی بەهای تەمەنی roGFP2 ئەنجامدرا کاتێک زیادکردنی 10 میلی مۆلی H2O2 دەرەکی بۆ ACSFی پەرفیوژن (بۆ زۆرترین ئۆکساندن، کە دەبێتە هۆی زیادبوونی تەمەن)، و پاشان زیادکردنی 2 میلی مۆلی دیتیۆترایتۆڵ (کەمترین پلەی کەمکردنەوە، لە ئەنجامدا کەمبوونەوەی لە تەمەنی ژیاندا) (شێوەی S8، D تا G). نەرمەکاڵای FLIMfit 5.1.1 بەکاربهێنە بۆ شیکردنەوەی ئەنجامە بەدەست هێنراوەکان، گونجاندنی تاکە کێوی خراپبوونی ڕیزبەندی تەواوی وێنەکە لەگەڵ IRFی پێوراو (کارکردی وەڵامی ئامێر)، و χ2 نزیکەی 1. بۆ حیسابی تەمەنی تاکە PN، دەمامکەکەی دەوری جەستەی دەمارەکان بە دەست کێشرا، و تێکڕای تەمەنی هەر ماسکێک بۆ ژماردن بەکارهات.
شیکاری پۆتانسێلی مایتۆکۆندریال. دوای ئەوەی بەشی توند لەگەڵ 100 نM TMRM کە ڕاستەوخۆ زیادکرا بۆ ACSFی پەرفیوژکراو بۆ ماوەی 30 خولەک کەرەوز کرا، گۆڕانکارییەکانی پۆتانسێلی مایتۆکۆندریاڵی PNs بە مایکرۆسکۆپی دوو فۆتۆن پێوانە کرا. وێنەگرتنی TMRM بە وروژاندنی پشکنەرەکە لە 920 نانۆمەتر و بەکارهێنانی HyD ناوخۆیی (تێترامیثیلرۆدامین ئایزۆتۆسیانات: 585/40 نانۆمەتر) بۆ کۆکردنەوەی سیگناڵەکان ئەنجامدرا؛ بە بەکارهێنانی هەمان درێژی شەپۆلی وروژاندن بەڵام بەکارهێنانی HyD ناوخۆیی جیاواز (FITC :525/50) بۆ وێنەگرتنی mtYFP. بۆ هەڵسەنگاندنی توانای مایتۆکۆندریال لە ئاستی تاکە خانەدا، پێوەکراوەکەی ImageJ’s Image Calculator بەکاربهێنە. بە کورتی، هاوکێشەی پلاگین: سیگناڵ = min (mtYFP، TMRM) بەکاردێت بۆ ناسینەوەی ناوچەی مایتۆکۆندریال کە سیگناڵی TMRM بە زمانی پورکینجی سۆماڵ لە وێنەی کۆنفۆکاڵی تاکە ستاکی کەناڵی هاوبەشدا نیشان دەدات. پاشان ڕووبەری پێکسڵ لە ماسکی دەرەنجامیدا ژمارەیی دەکرێت، و پاشان لەسەر وێنەی تاکە ستاکی ئاستبەرزی هاوتا لە کەناڵی mtYFP ئاسایی دەکرێتەوە بۆ بەدەستهێنانی بەشە مایتۆکۆندریالەکە کە پۆتانسێلی مایتۆکۆندریال نیشان دەدات.
وێنەکە بە نەرمەکاڵای Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) وەرگیرا. بۆ وێنە سکانکراوەکانی کاشیەکان، مۆنتاژی تاکە کاشییەک بە بەکارهێنانی ئەلگۆریتمەکەی دروومانی ئۆتۆماتیکی کە لەلایەن نەرمەکاڵای LAS-X دابینکراوە دروست دەکرێت. دوای قەبارەدانانی وێنە، ImageJ و Adobe Photoshop بەکاربهێنە بۆ زیاتر پرۆسێسکردنی وێنەکە و ڕێکخستنی ڕووناکی و کۆنتراست بە شێوەیەکی یەکسان. بۆ ئامادەکردنی گرافیک ئەدۆبی ئیلسترەیتۆر بەکاربهێنە.
شیکاری فۆکەسی mtDNA. ژمارەی برینەکانی mtDNA لەسەر بەشەکانی مێشکچک کە بە دژەتەن دژی DNA بە مایکرۆسکۆپی کۆنفۆکاڵی نیشانە کرابوون، ژمارەیی کرا. هەر ناوچەیەکی ئامانج بۆ جەستەی خانە و ناوکی هەر خانەیەک دروستکرا، و ڕووبەری تایبەت بە خۆیان بە بەکارهێنانی پێوەکراوەکەی Multi Measure (نەرمەکاڵای ImageJ) حیسابی بۆ کرا. ڕووبەری ناوکی لە ناوچەی جەستەی خانەکە کەم بکەرەوە بۆ بەدەستهێنانی ڕووبەری سایتۆپلازمی. لە کۆتاییدا، پێوەکراوەکەی شیکاری گەردیلەکان (نەرمەکاڵای ImageJ) بەکارهێنرا بۆ ژماردنی ئۆتۆماتیکی خاڵەکانی DNAی سایتوبڵازمی کە ئاماژە بە mtDNA دەکەن لەسەر وێنەی ئاست، و ئەنجامە بەدەست هێنراوەکان ئاسایی کران بۆ تێکڕای PNی مشکەکانی CTRL. ئەنجامەکان بە تێکڕای ژمارەی نیوکلیۆسایدەکان لە هەر خانەیەکدا دەربڕدراون.
شیکاری دەربڕینی پڕۆتین. بۆ هەڵسەنگاندنی دەربڕینی پڕۆتین لە PN لە ئاستی تاکە خانەدا، پێوەکراوەکەی ImageJ’s Image Calculator بەکاربهێنە. بە کورتی، لە وێنەی تاکە چینە کۆنفۆکاڵی کەناڵی هاوبەشدا، لە ڕێگەی هاوکێشە: سیگناڵ = min (mtYFP، دژەتەن)، ناوچەی مایتۆکۆندریال کە کاردانەوەی بەرگری بۆ دژەتەنێکی دیاریکراو لە پورکینا نیشان دەدات، دەستنیشان دەکرێت. پاشان ڕووبەری پێکسڵەکان لە ماسکی دەرەنجامییدا ژمارەیی دەکرێت، و پاشان لەسەر وێنەی تاکە ستاکی ئاستبەرزی هاوتا لە کەناڵی mtYFP ئاسایی دەکرێتەوە بۆ بەدەستهێنانی بەشە مایتۆکۆندریاڵی پڕۆتینی پیشان دراو.
شیکاری چڕی خانەکانی پورکینجە. پلاگینی ژمێرەری خانەکانی ImageJ بەکارهات بۆ هەڵسەنگاندنی چڕی پورکینجە بە دابەشکردنی ژمارەی خانەکانی پورکینجە کە ژماردرابوون بەسەر درێژی ئەڵقەی مێشکچک کە لەلایەن خانە ژماردراوەکانەوە داگیرکراوە.
ئامادەکردن و کۆکردنەوەی نمونە. مێشکی گروپی کۆنترۆڵ و مشکەکانی Mfn2cKO لە 2% PFA/2.5% گلوتارالدەهید لە 0.1 M فۆسفات بافەر (PB) جێگیرکران، و پاشان بەشە تاجەییەکان بە بەکارهێنانی سیلیاتەکان (Leica Mikrosysteme GmbH، ڤیەنا، نەمسا) ئامادەکران (ئەستووری 50 بۆ 60 میکرۆمتر) پاشان لە PB بافەر لە 1% ئۆست تێترۆکساید جێگیرکران و... 1.5% پۆتاسیۆم فێرۆسیاناید لە پلەی گەرمی ژووردا بۆ ماوەی 1 کاتژمێر. بەشەکان سێ جار بە ئاوی پاک شۆردران، و پاشان بە 70% ئیتانۆل کە 1% یورانیل ئەسیتاتی تێدایە بۆ ماوەی 20 خولەک ڕەنگ کران. پاشان بەشەکان لە ئەلکهولێکی پلەبەندیدا ئاوچنیان کران و لە ڕزینی ئیپۆکسی Durcupan ACM (Araldite casting resin M) (زانستەکانی مایکرۆسکۆپی ئەلیکترۆنی، ژمارەی کەتەلۆگ 14040) لە نێوان سلایدەکانی شووشەی پۆشراو بە سیلیکۆن جێگیرکران، و لە کۆتاییدا لە پلەی گەرمی 60 پلەی سەدیدا پۆلیمرکردن لە فڕندا بۆ ماوەی 48 کاتژمێر. ناوچەی قۆڵۆنی مێشکچک هەڵبژێردرا و بەشە زۆر تەنکەکانی 50 نانۆمەتر لەسەر لایکا ئۆڵتراکات (Leica Mikrosysteme GmbH، ڤیەنا، نەمسا) بڕدرا و لەسەر تۆڕێکی درزاوی مسی 2×1 ملم هەڵگیرا کە بە فیلمی پۆلیستێرینی پۆشرابوو. بەشەکان بە گیراوەی 4% یورانیل ئەسیتات لە H2O بۆ ماوەی 10 خولەک ڕەنگ کران، چەند جارێک بە H2O شۆردران، پاشان بە ڕینۆڵدز لید سیترات لە H2O بۆ ماوەی 10 خولەک، پاشان بە H2O چەند جارێک شۆردران. وردەگرافەکان بە مایکرۆسکۆپی ئەلکترۆنی گواستنەوە Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific، Waltham، MA، USA) بە بەکارهێنانی TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) کامێرای دیجیتاڵی TemCam-F416 (TVIPS GmbH، Gauting، USA) گیرا. ئەڵمانیا).
بۆ مشکەکانی تووشبوو بە AAV، مێشک جیاکرایەوە و پارچە پارچە کرا بۆ بەشێکی ساجیتاڵی ئەستووری 1 ملم، و مێشکچکەکە بە بەکارهێنانی مایکرۆسکۆپی فلۆرۆسەنس پشکنین کرا بۆ ناسینەوەی ئەڵقەی تووشبوو بە AAV (واتە دەربڕینی mCherry). تەنها ئەو تاقیکردنەوانە کە دەرزی AAV ئەنجامەکەی کارایی گواستنەوەی زۆر بەرزی چینە خانەی پورکینجە (واتە نزیکەی تەواوی چینەکە) لە لانیکەم دوو ئەڵقەی مێشکچکەی یەک لە دوای یەکدا بەکاردەهێنرێت. لوپی گواستراو بە AAV مایکرۆدیسێکت کرا بۆ ماوەی شەوێک دوای جێگیرکردن (4% PFA و 2.5% گلوتارالدەهید لە 0.1 M کۆکۆت بافەر) و زیاتر پرۆسێس کرا. بۆ جێگیرکردنی EPON، شانە جێگیرەکان بە 0.1 M سۆدیۆم کۆکۆت بافەر (Applichem) شۆردران، و لەگەڵ 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) لە 0.1 M سۆدیۆم کۆکۆت بافەر (Applichem) 4 کاتژمێر کەرەوز کران، پاشان بۆ ماوەی 2 کاتژمێر شۆردران. 3 جار دووبارەی بکەرەوە بە 0.1 M کۆکامید بافەر. دواتر زنجیرەی بەرزبوونەوەی ئیتانۆل بەکارهێنرا بۆ کەرەوزکردنی هەر گیراوەیەکی ئیتانۆل لە پلەی گەرمی 4 پلەی سەدی بۆ ماوەی 15 خولەک بۆ ئاوچنیانی شانەکە. شانەکە گواسترایەوە بۆ ئۆکسیدی پرۆپیلین و بۆ ماوەی شەوێک لە EPON (Sigma-Aldrich) لە پلەی گەرمی 4 پلەی سەدیدا کەرەوز کرا. شانەکان بخەرە ناو EPON ی تازە لە پلەی گەرمی ژووردا بۆ ماوەی 2 کاتژمێر، و پاشان لە پلەی گەرمی 62 پلەی سەدی بۆ ماوەی 72 کاتژمێر بیخەنە ناوەوە. بەکارهێنانی ئۆڵترامایکرۆتۆم (Leica Microsystems, UC6) و چەقۆی ئەڵماس (Diatome, Biel, Switzerland) بۆ بڕینی بەشە زۆر تەنکەکانی 70 نانۆمەتر، و ڕەنگکردنی بە 1.5% یورانیل ئەسیتات بۆ ماوەی 15 خولەک لە پلەی گەرمی 37 پلەی سەدی، و ڕەنگکردنی بە گیراوەی سیتراتی سرکە بۆ ماوەی 4 خولەک. وردە وێنە ئەلکترۆنییەکان بە بەکارهێنانی مایکرۆسکۆپی ئەلکترۆنی گواستنەوەی JEM-2100 Plus (JEOL) گیراوە کە بە Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) و نەرمەکاڵای DigitalMicrograph (Gatan) تەیار کراوە. بۆ شیکاری، مایکرۆگرافی ئەلکترۆنی بە زوومی دیجیتاڵی 5000× یان 10,000× وەرگیرا.
شیکاری مۆرفۆلۆژی مایتۆکۆندریای. بۆ هەموو شیکارییەکان، کۆنتورەکانی تاکەکەسی مایتۆکۆندریای بە دەست لە وێنە دیجیتاڵییەکان بە بەکارهێنانی نەرمەکاڵای ImageJ هێڵکاری کران. پارامێتەرەکانی مۆرفۆلۆژی جیاواز شی دەکرێنەوە. چڕی مایتۆکۆندریالەکان وەک ڕێژەیەک دەربڕدراوە کە بەدەست هاتووە بە دابەشکردنی کۆی ڕووبەری مایتۆکۆندریاڵی هەر خانەیەک بەسەر ڕووبەری سایتوبڵازما (ڕووبەری سایتوبڵازما = ڕووبەری خانە-ڕووبەری ناوکی خانە) × 100. دەوری مایتۆکۆندریالەکان بە فۆرمۆلەی [4π∙(ڕووبەر/دەوری 2)] حیسابی بۆ دەکرێت. مۆرفۆلۆژیای ئیستای مایتۆکۆندریای شیکرایەوە و بەپێی شێوە سەرەکییەکانیان دابەشکرا بەسەر دوو پۆلدا ("بۆری" و "تاڵە موو").
شیکاری ژمارەی ئۆتۆفاگۆزۆم/لایسۆزۆم و چڕی. نەرمەکاڵای ImageJ بەکاربهێنە بۆ ئەوەی بە دەستی کۆنتورەکانی هەر ئۆتۆفاگۆزۆم/لایسۆزۆمێک لە وێنەی دیجیتاڵیدا دابڕێژیت. ڕووبەری ئۆتۆفاگۆزۆم/لایسۆزۆم وەک ڕێژەیەک دەربڕدراوە کە بە دابەشکردنی کۆی ڕووبەری پێکهاتەی ئۆتۆفاگۆزۆم/لایسۆزۆمی هەر خانەیەک بەسەر ڕووبەری سایتوبڵازما (ڕووبەری سایتوبڵازما=ڕووبەری خانە-ڕووبەری ناوکی)×100 حیسابی بۆ دەکرێت. چڕی ئۆتۆفاگۆزۆمەکان/لایسۆزۆمەکان بە دابەشکردنی کۆی ژمارەکە بەسەر ژمارەی پێکهاتەکانی ئۆتۆفاگۆزۆم/لایسۆزۆم بۆ هەر خانەیەک (لە ڕووی ڕووبەری سایتوبڵازمی) (ڕووبەری سایتوبڵازمی = ڕووبەری خانە-ڕووبەری ناوکی) حیسابی بۆ دەکرێت.
ئاماژەدان بۆ بەشی توند و ئامادەکردنی نمونە. بۆ ئەو تاقیکردنەوانە کە پێویستیان بە نیشاندانی گلوکۆز هەیە، پارچە توندەکانی مێشک بگوازەرەوە بۆ ژوورێکی پێش کەرەوزکردن، کە کاربۆنی تێر (95% O2 و 5% CO2)، Ca2 + ACSF بەرز (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM سۆدیۆم فۆسفات بافەر، 25.0 mM NaHCO 3، 25.0 mM لەخۆدەگرێت d-glucose، 1.0 mM CaCl 2 و 2.0 mM MgCl 2، ڕێکخراوە بۆ pH 7.4 و 310 بۆ 320 mOsm)، کە تێیدا گلوکۆز 13 C 6- جێگرەوەی گلوکۆزە (Eurisotop، ژمارەی کەتەلۆگ CLM-1396). بۆ ئەو تاقیکردنەوانە کە پێویستیان بە نیشانەکردنی پیرۆڤات هەیە، پارچە توندەکانی مێشک بگوازەرەوە بۆ Ca2 + ACSF بەرزتر (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM سۆدیۆم فۆسفات بافەر، 25.0 mM NaHCO3، 25.0 mM d-glucose، 1.0 mM CaCl2 و زیادکردنی 2.0mM MgCl2، ڕێکبخە بۆ pH 7.4 و 310 بۆ 320mOsm)، و 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop، ژمارەی کەتەلۆگ CLM-1082) زیاد بکە. بەشەکان بۆ ماوەی ٩٠ خولەک لە پلەی گەرمی ٣٧ پلەی سەدیدا کەرەوز بکە. لە کۆتایی تاقیکردنەوەکەدا، بەشەکان بە خێرایی بە گیراوەیەکی ئاوی (pH 7.4) شۆردران کە 75 میلی مۆلی کاربۆناتی ئەمۆنیۆمی تێدابوو، و پاشان لە 40:40:20 (v:v:v) ئەسیتۆنیتڕیل (ACN): مێتانۆل: ئاودا یەکسان کران. دوای ئەوەی بەشەکان لەسەر سەهۆڵ بۆ ماوەی 30 خولەک کەرەوز کران، نموونەکان لە 21,000 گم بۆ ماوەی 10 خولەک لە پلەی گەرمی 4 پلەی سەدیدا سەنتەرفۆج کران، و شلەی سەرەوەی ڕوون لە چڕکەرەوەی SpeedVac وشککرایەوە. گوللەی میتابۆلیتە وشککراوەی دەرهاویشتوو لە پلەی گەرمی -80 پلەی سەدی هەڵگیرا تا شیکاری.
شیکاری کرۆماتۆگرافی شلە-سپێکترۆمێتری بارستەیی 13 ترشی ئەمینی C-نیشانەی. بۆ شیکاری کرۆماتۆگرافی شلە-سپێکترۆمێتری بارستەیی (LC-MS)، گوللەی میتابۆلیتەکە لە 75μl ئاوی پلەی LC-MS (Honeywell) هەڵواسرا. پاش سەنتەرفۆجکردن لە 21,000 گم بۆ ماوەی 5 خولەک لە پلەی گەرمی 4 پلەی سەدی، 20 میکرۆلیتر لە شلەی سەرەوەی ڕوونکراوە بۆ شیکاری شلەی ترشە ئەمینییەکان بەکارهێنرا، لە کاتێکدا باقی دەرهێنراوەکە دەستبەجێ بۆ شیکاری ئەنیونەکان بەکارهێنرا (بڕوانە خوارەوە). شیکاری ترشە ئەمینیەکان بە بەکارهێنانی پرۆتۆکۆڵی وەرگیرانی بەنزۆیل کلۆرید کە پێشتر باسکراوە ئەنجامدرا (55، 56). لە هەنگاوی یەکەمدا، 10 میکرۆلیتر 100 میلی مۆلی کاربۆناتی سۆدیۆم (سیگما-ئەلدریچ) زیادکرا بۆ 20 میکرۆلیتر دەرهاویشتەی میتابۆلیت، و پاشان 10 میکرۆلیتر 2% بەنزۆیل کلۆرید (سیگما-ئاڵدریچ) زیادکرا بۆ پلەی LC ACN. نمونەکە بۆ ماوەیەکی کورت گێژەڵوکە کرا و پاشان لە 21,000 گم بۆ ماوەی 5 خولەک لە پلەی گەرمی 20 پلەی سەدیدا سەنتەرفۆج کرا. شلەی سەرەوەی پاککراوە بگوازەرەوە بۆ ناو کوپێکی ئۆتۆسامپلەری 2 مل بە ئینسەرتی شووشەی مەخرەجی (200 میکرۆلیتر قەبارە). نمونەکان بە بەکارهێنانی سیستەمی LC ​​ی کارایی زۆر بەرزی Acquity iClass (Waters) شیکرانەوە کە بەستراوەتەوە بە سپێکترۆمێتری بارستەیی وردبینی بەرزی Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). بۆ شیکاری، 2 میکرۆلیتر لە نمونەی وەرگیراو دەرزی لێدرا بۆ ناو ستوونی سیلیکای T3ی بەهێزی بەرزی 100×1.0 ملم (ئاوەکان) کە گەردیلەکانی 1.8 میکرۆمەتر لەخۆگرتبوو. ڕێژەی لێشاوی 100μl/min، و سیستەمی بافەر پێکدێت لە بافەر A (10 mM فۆرماتی ئەمۆنیۆم و 0.15% ترشی فۆرمیک لە ئاودا) و بافەر B (ACN). گرادێنتەکە بەم شێوەیەیە: 0%B لە 0 خولەکدا؛ 0%B. 0 بۆ 15% B لە 0 بۆ 0.1 خولەکدا؛ 15 بۆ 17% B لە 0.1 بۆ 0.5 خولەک؛ B لە 17 بۆ 55% لە 0.5 بۆ 14 خولەک؛ B لە 55 بۆ 70% لە 14 بۆ 14.5 خولەک؛ لە 14.5 بۆ 70 بۆ 100% B لە 18 خولەکدا؛ 100% B لە 18 بۆ 19 خولەکدا؛ 100 بۆ 0% B لە 19 بۆ 19.1 خولەکدا؛ 0% B لە 19.1 بۆ 28 خولەک (55، 56). سپێکترۆمێتری بارستەیی QE-HF لە دۆخی ئایۆنیزەکردنی ئەرێنیدا کاردەکات بە مەودای بارستەی m/z (رێژەی بارستە/بارگاوی) 50 بۆ 750. ڕوونی بەکارهێنراو 60,000 یە، و ئامانجی ئایۆنی کۆنترۆڵی بەدەستهێنان (AGC) کە بەدەست هاتووە 3×106 یە، و زۆرترین کاتی ئایۆن 100 میلی چرکە. سەرچاوەی ئایۆنیزەکردنی ئەلکترۆسپرای گەرمکراو (ESI) بە ڤۆڵتیەی سپرای 3.5 کیلۆڤۆڵت، پلەی گەرمی موولوولەیی 250 پلەی سەدی، ڕۆیشتنی هەوای غەلافی 60 AU (یەکە ئارەزوومەندانەکان) و ڕۆیشتنی هەوای یارمەتیدەر بە 20 AU کاردەکات. ٢٥٠ پلەی سەدی. عەدەسەی S لەسەر 60 AU دانراوە.
شیکاری کرۆماتۆگرافی ئەنیون-MS بۆ ترشە ئۆرگانییە نیشانەکراوەکانی 13C. ڕەشبوونەوەی میتابۆلیتە ماوەتەوە (55μl) بە بەکارهێنانی سیستەمی کرۆماتۆگرافی ئایۆنی Dionex (ICS 5000+، Thermo Fisher Scientific) کە بەستراوەتەوە بە سپێکترۆمێتری بارستەیی QE-HF (Thermo Fisher Scientific) شیکرایەوە. بە کورتی، 5μl دەرهاویشتەی میتابۆلیت دەرزی لێدرا بۆ ناو ستوونی Dionex IonPac AS11-HC کە بە HPLC (2 mm×250 mm، قەبارەی تەنۆلکەکان 4μm، Thermo Fisher Scientific) لە دۆخی پاڵنانی بەشەکی لوپی پاڵنانی ناوەوە بە ڕێژەی پڕکردنەوەی 1. ) ستوونی پارێزەری Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm، 4μm، Thermo فیشەر زانستی). پلەی گەرمی ستوونەکە لە ٣٠ پلەی سەدیدا دەهێڵرێتەوە، و ئۆتۆسامپلەرەکە لەسەر ٦ پلەی سەدی دانراوە. کارتێژی هایدرۆکسیدی پۆتاسیۆم بەکاربهێنە کە ئاوی بێ ئایۆنیزکراوی تێدایە بۆ دروستکردنی گرادێنتێکی هایدرۆکسیدی پۆتاسیۆم لە ڕێگەی مۆلیدەی شلکەرەوە. جیاکردنەوەی میتابۆلیتەکان بە ڕێژەی لێشاوی 380μl/min، بەکارهێنانی ئەم گرادێنتەی خوارەوە: 0 بۆ 3 خولەک، 10 mM KOH؛ ٣ بۆ ١٢ خولەک، ١٠ بۆ ٥٠ میلی مۆلی KOH؛ 12 بۆ 19 خولەک، 50 بۆ 100 میلی مۆلی KOH؛ 19 بۆ 21 خولەک , 100 میلی مۆلی KOH; ٢١ بۆ ٢١.٥ خولەک، ١٠٠ بۆ ١٠ میلی مۆلی KOH. ستوونەکە لە ژێر 10 میلی مۆلی KOH بۆ ماوەی 8.5 خولەک هاوسەنگ کرایەوە.
میتابۆلیتە شۆردراوەکان لەگەڵ ڕژێمی تەواوکەری ئایزۆپرۆپانۆلی 150μl/min دوای ستوونەکە تێکەڵ دەکرێن و پاشان ئاراستە دەکرێن بۆ سپێکترۆمێتری بارستەیی ڕوونی بەرز کە لە دۆخی ئایۆنیزەکردنی نەرێنیدا کاردەکات. MS چاودێری مەودای بارستە دەکات لە m/z 50 تا 750 بە ڕوونی 60,000. AGC لەسەر 1×106 دانراوە، و زۆرترین کاتی ئایۆن لە 100 میلی سێکانتدا دەهێڵرێتەوە. سەرچاوەی گەرمکراوی ESI بە ڤۆڵتیەی سپرای 3.5 کیلۆڤۆڵت کارپێکرا. ڕێکخستنەکانی تری سەرچاوەی ئایۆنەکە بەم شێوەیەن: پلەی گەرمی موولوولەیی ٢٧٥ پلەی سەدی؛ ڕۆیشتنی گازی غەلاف، 60 AU؛ ڕۆیشتنی گازی یارمەتیدەر، 20 AU لە پلەی گەرمی 300 پلەی سەدی، و ڕێکخستنی عەدەسەی S بۆ 60 AU.
شیکاری داتاکانی میتابۆلیتە نیشانەکراوەکانی 13C. بۆ شیکاری داتاکانی ڕێژەی ئایزۆتۆپەکان نەرمەکاڵای TraceFinder (وەشان 4.2، Thermo Fisher Scientific) بەکاربهێنە. ناسنامەی هەر ئاوێتەیەک بە ئاوێتەیەکی ئاماژەی متمانەپێکراو پشتڕاستکرایەوە و بە شێوەیەکی سەربەخۆ شیکرایەوە. بۆ ئەنجامدانی شیکاری دەوڵەمەندکردنی ئایزۆتۆپ، ڕووبەری کرۆماتۆگرامی ئایۆنی دەرهێنراو (XIC)ی هەر ئایزۆتۆپێکی 13C (Mn) لە [M + H] + دەرهێنرا، کە n ژمارەی کاربۆنی پێکهاتەی ئامانجە، بەکاردێت بۆ شیکردنەوەی ترشە ئەمینییەکان یان [ MH] + بەکاردێت بۆ شیکردنەوەی ئەنیۆنەکان. وردی بارستەیی XIC کەمترە لە پێنج بەش لە ملیۆنێکدا، و وردی RT 0.05 خولەکە. شیکاری دەوڵەمەندکردن بە حیسابی ڕێژەی هەر ئایزۆتۆپێکی دۆزراو بە کۆی هەموو ئایزۆتۆپەکانی ئاوێتە هاوبەشەکە ئەنجام دەدرێت. ئەم ڕێژانە وەک بەهای لەسەدا بۆ هەر ئایزۆتۆپێک دراون، و ئەنجامەکان بە شێوەی دەوڵەمەندکردنی لەسەدی مۆلی (MPE) دەربڕدراون، وەک پێشتر باسکراوە (42).
گوللەی دەمارە بەستووەکە لە 80% میتانۆلی ساردی سەهۆڵاوی (v/v)دا یەکسان کرا، گێژەڵوکەیی کرا و لە پلەی گەرمی -20 پلەی سەدی بۆ ماوەی 30 خولەک کەرەوز کرا. دووبارە نمونەکە گێژەڵوکە بکە و لە پلەی گەرمی +4 پلەی سەدی بۆ ماوەی ٣٠ خولەک تێکی ​​بدە. نمونەکە لە 21,000 گم بۆ ماوەی 5 خولەک لە پلەی گەرمی 4 پلەی سەدی سەنتەرفۆج کرا، و پاشان شلەی سەرەوەی دەرهاویشتوو کۆکرایەوە و وشککرایەوە بە بەکارهێنانی چڕکەرەوەی SpeedVac لە پلەی گەرمی 25 پلەی سەدی بۆ شیکاری دواتر. وەک لە سەرەوە باسکراوە، شیکاری LC-MS لەسەر ترشە ئەمینیەکانی خانە ڕیزکراوەکان ئەنجامدرا. بە بەکارهێنانی TraceFinder (وەشان 4.2، Thermo Fisher Scientific)، شیکاری داتاکان بە بەکارهێنانی بارستەی تاک ئایزۆتۆپی هەر ئاوێتەیەک ئەنجامدرا. ئاساییکردنەوەی کوانتایلی داتاکانی میتابۆلیتەکان بە بەکارهێنانی پاکێجی نەرمەکاڵای preprocessCore ئەنجامدرا (57).
ئامادەکردنی پارچە. مشکەکە بە خێرایی بە دووەم ئۆکسیدی کاربۆن بێهۆش کرا و سەری بڕی، مێشکی بە خێرایی لە کەللەسەری دەرهێنرا، هەروەها چەقۆی لەرزین کە پڕ بوو لە سەهۆڵ (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) بەکارهێنرا بۆ بڕینی بۆ بەشی ساجیتاڵی 300 بۆ 375 میکرۆمەتر غازکردنی کاربۆنی سارد (95% O2 و 5% CO2) کەم Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM سۆدیۆم فۆسفات بافەر، 25.0 mM NaHCO3، 25.0 mM d-glucose، 1.0 mM CaCl2 و 6.0 mM MgCl2 ڕێکبخە بۆ pH 7.4 و 310 بۆ 330 mOsm). پارچە مێشکی بەدەست هاتوو بگوازەرەوە بۆ ژوورێک کە Ca2 + ACSF بەرزتری تێدایە (125.0 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM سۆدیۆم فۆسفات بافەر، 25.0 mM NaHCO3، 25.0 mM d-glucose، 4.0 mM CaCl2 و mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 و 310 بۆ 320 mOsm). پارچەکان بۆ ماوەی ٢٠ بۆ ٣٠ خولەک هەڵبگرە بۆ ئەوەی بتوانرێت پێش تۆمارکردن بگەڕێنرێنەوە.
تۆمارکردن. قۆناغێکی مایکرۆسکۆپی کە ژوورێکی تۆمارکردنی جێگیر و عەدەسەی ئامانجی نوقمکردنی ئاوی ٢٠ هێندەی (Scientifica) تەیار کراوە بۆ هەموو تۆمارەکان بەکارهێنرا. خانە گوماناوییەکانی پورکینجە بە (i) قەبارەی جەستە، (ii) شوێنی ئەناتۆمی مێشکچک، و (iii) دەربڕینی جینی پەیامنێری mtYFPی فلۆرۆسەنت دەستنیشان کران. پیپێتی پەچە کە بەرگری نووکەکەی 5 بۆ 11 مێگۆم بێت لەلایەن موولوولەیەکی شووشەی بۆرۆسیلیکات (GB150-10، 0.86 ملم×1.5 ملم×100 ملم، بەرهەمە زانستییەکان، هۆفهایم، ئەڵمانیا) و پیپێتی ئاسۆیی ئامێرەکان (P-1000، سوتەر)، نۆڤاتۆ، سی ئەی دەکێشرێتە دەرەوە. هەموو تۆمارەکان بە ئامێری ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH، Tam، Germany) ئەنجامدراون، کە لەلایەن نەرمەکاڵای Signal (وەشان 6.0، Cambridge Electronic، Cambridge، UK) کۆنترۆڵکرابوو. تاقیکردنەوەکە بە ڕێژەی نمونەگرتن 12.5 کیلۆهێرتز تۆمارکرا. سیگناڵەکە بە دوو فلتەری شۆرت پاسی بێسێل فلتەر دەکرێت کە فرێکوێنسی بڕینیان بە ڕێککەوت 1.3 و 10 کیلۆهێرتزە. توانای پەردە و پیپێتەکە لەلایەن بازنەی قەرەبووکردنەوە بە بەکارهێنانی ئامێری گەورەکەرەوە قەرەبوو دەکرێتەوە. هەموو تاقیکردنەوەکان لە ژێر کۆنترۆڵی کامێرای ئۆرکا-فلاش ٤.٠ (هاماماتسۆ، گێردن، ئەڵمانیا) ئەنجامدراون، کە بە نەرمەکاڵای هۆکاو (وەشان ٢.٨، هاماماتسو، گێردن، ئەڵمانیا) کۆنترۆڵکرابوو.
ڕێکخستن و شیکاری ڕۆتینی تەواوی خانەکان. ڕاستەوخۆ پێش تۆمارکردن، پیپێتەکە پڕ بکە لە گیراوەی ناوەوە کە ئەم مادانەی خوارەوەی تێدایە: 4.0 mM KCl، 2.0 mM NaCl، 0.2 mM EGTA، 135.0 mM پۆتاسیۆم گلوکۆنات، 10.0 mM Hepes، 4.0 mM ATP (Mg)، 0.5 mM Guanosine triphosphate (GTP) (Na) و 10.0 میلی مۆلی کریاتینین فۆسفات ڕێکخرا بۆ pH 7.25، و پەستانی گەرمی 290 میلی مۆلی (سوکارۆز) بوو. ڕاستەوخۆ دوای بەکارهێنانی هێزێکی 0 pA بۆ پچڕانی پەردەکە، پۆتانسێلی پەردەی پشوودان پێوانە کرا. بەرگری هاتنەژوورەوە بە بەکارهێنانی جەریانی زۆر جەمسەری -40، -30، -20، و -10 pA دەپێورێت. گەورەیی وەڵامی ڤۆڵتیە بپێو و یاسای ئۆم بەکاربهێنە بۆ حیسابی بەرگری هاتنەژوورەوە. چالاکیی خۆبەخۆ لە گیرەی ڤۆڵتیە بۆ ماوەی 5 خولەک تۆمارکرا، و sPSC لە Igor Pro (وەشان 32 7.01، WaveMetrics، Lake Oswego، Oregon، USA) بە بەکارهێنانی سکریپتی ناسینەوەی نیمچە ئۆتۆماتیکی دەستنیشانکرا و پێوانە کرا. کێوی IV و کارەبای دۆخی جێگیر بە گرتنی پاتری لە پۆتانسێلی جیاوازدا (لە -110 mV دەست پێدەکات) و زیادکردنی ڤۆڵتیە بە هەنگاوی 5 mV دەپێورێت. بەرهەمهێنانی AP بە بەکارهێنانی کارەبای جەمسەری لابردن تاقیکرایەوە. خانەکە لە پلەی گەرمی -70 میلی ڤۆڵتدا بگرە لەکاتی بەکارهێنانی پەلسی کارەبای بێ جەمسەری. قەبارەی هەنگاوی هەر یەکەیەکی تۆمارکردن بە جیا ڕێکبخە (10 بۆ 60 pA). زۆرترین فرێکوێنسی AP حیساب بکە بە ژماردنی دەستی ئەو پەستانە پەلسیانەی کە دەبنە هۆی بەرزترین فرێکوێنسی AP. ئاستی AP بە بەکارهێنانی وەرگیراوی دووەمی پەلسی بێ جەمسەری شیکاری دەکرێت کە سەرەتا یەک یان چەند APێک دەستپێدەکات.
ڕێکخستن و شیکاری پەچەی کونکراو. تۆمارکردنی پەچەی کونکراو ئەنجام بدە بە بەکارهێنانی پرۆتۆکۆڵە ستانداردەکان. پیپێتێکی بێ ATP و GTP بەکاربهێنە کە ئەم پێکهاتانەی خوارەوەی تێدا نەبێت: 128 mM گلوکۆنات K، 10 mM KCl، 10 mM Hepes، 0.1 mM EGTA و 2 mM MgCl2، و ڕێکبخە بۆ pH 7.2 (بە بەکارهێنانی KOH). ATP و GTP لە گیراوەی ناو خانەدا لادەبرێن بۆ ڕێگریکردن لە ڕژانی کۆنترۆڵنەکراوی پەردەی خانەکە. پیپێتی پەچە پڕ دەکرێتەوە لە گیراوەیەکی ناوەکی کە ئەمفۆتێریسین تێدایە (نزیکەی 200 بۆ 250 میکرۆگرام/میلی لیتر؛ G4888، سیگما-ئەلدریچ) بۆ بەدەستهێنانی تۆماری پەچەی پەنجەدار. ئەمفۆتێریسین لە دیمیثیل سەلفۆکسایددا تواوەتەوە (چڕیی کۆتایی: 0.1 بۆ 0.3%؛ DMSO؛ D8418، سیگما-ئاڵدریچ). چڕیی DMSO بەکارهێنراو هیچ کاریگەرییەکی بەرچاوی لەسەر ئەو دەمارانەی کە لێکۆڵینەوەیان لەسەر کراوە نەبووە. لە کاتی پرۆسەی پەنجەدان، بەرگری کەناڵ (Ra) بە بەردەوامی چاودێری کرا، و تاقیکردنەوەکە دەستی پێکرد دوای ئەوەی گەورەیی Ra و AP جێگیر بوو (20-40 خولەک). چالاکیی خۆبەخۆ لە گیرەی ڤۆڵتیە و/یان کارەبادا بۆ ماوەی ٢ بۆ ٥ خولەک دەپێورێت. شیکاری داتاکان بە بەکارهێنانی Igor Pro (وەشان 7.05.2، WaveMetrics، ئەمریکا)، Excel (وەشان 2010، Microsoft Corporation، Redmond، USA) و GraphPad Prism (وەشان 8.1.2، GraphPad Software Inc.، La Jolla، CA) ئەنجامدرا. ئەمریکا). بۆ ئەوەی AP خۆبەخۆکان دەستنیشان بکرێت، پێوەکراوەکەی NeuroMatic v3.0c ی IgorPro بەکاردەهێنرێت. بە شێوەیەکی ئۆتۆماتیکی APەکان بناسە بە بەکارهێنانی ئاستێکی دیاریکراو، کە بە تاک بۆ هەر تۆمارێک ڕێکدەخرێت. بە بەکارهێنانی نێوان سپایک، فرێکوێنسیی سپایک بە زۆرترین فرێکوێنسی سپایکی چرکەساتی و تێکڕای فرێکوێنسی سپایک دیاری بکە.
دابڕانی PN. بە گونجاندن لەگەڵ پرۆتۆکۆڵی پێشتر بڵاوکراوە، PNs لە مێشکی مشک لە قۆناغێکی دیاریکراودا پاککرایەوە (58). بە کورتی، مێشکچکەکە پارچە پارچە کرا و لە ناوەندی جیاکردنەوەی ساردی سەهۆڵاویدا وردکرا [بەبێ HBSS Ca2+ و Mg2+، تەواوکەری 20 میلی مۆلی گلوکۆز، پەنسلین (50 U/ml) و سترێپتۆمایسین (0.05 mg/ml)]، و پاشان ناوەندەکە لە پاپایندا هەرسکرا [HBSS، تەواوکەری 1-cysteine·HCl (1 میلیگرام/میلی لیتر)، پاپاین (16 یو/ملی لیتر) و دیۆکسی ڕیبۆنۆکلیاز I (DNase I؛ 0.1 میلیگرام/میلی لیتر)] بۆ ماوەی 30 خولەک لە پلەی گەرمی 30 پلەی سەدی چارەسەر بکە. سەرەتا شانەکان لە ناوەندێکی HBSS کە چڵمی هێلکەی تێدایە (10 میلیگرام/میلی لیتر)، BSA (10 میلیگرام/میلی لیتر) و DNase (0.1 میلیگرام/میلی لیتر) لە پلەی گەرمی ژووردا بشۆ بۆ ڕێگریکردن لە هەرسکردنی ئەنزیمی، پاشان لە ناوەندێکی HBSS کە 20 میلی مۆلی گلوکۆزی تێدایە بە نەرمی لە HBSS، پەنسلین (50 U/ml)، سترێپتۆمایسین (0.05 میلیگرام/میلی لیتر) و DNase (0.1 mg/ml) تاکە خانەکان ئازاد دەکات. هەڵپەسێردراوی خانەکانی دەرهاویشتوو لە ڕێگەی پاڵاوتەی خانەکانی 70 میکرۆمترەوە فلتەر کرا، پاشان خانەکان بە سەنتەرفۆجکردن (1110 خولەک لە خولەکێکدا، 5 خولەک، 4 پلەی سەدی) گوللە کران و لە ناوەندی ڕیزکردندا هەڵواسرانەوە [HBSS، تەواوکەری 20 میلی مۆلی گلوکۆز، 20% کۆرپەی گا) سیرۆم، پەنسلین (50 U/ml) و سترێپتۆمایسین (0.05 میلیگرام/ملی لیتر)]؛ هەڵسەنگاندنی توانای زیندوویی خانەکان بە پرۆپیدیۆم یۆداید و ڕێکخستنی چڕی خانەکان بۆ 1×106 بۆ 2×106 خانە/میلی لیتر. پێش خانەپێوانی لێشاو، هەڵپەسێردراوەکە لە ڕێگەی پاڵاوتەی خانەکانی 50 میکرۆمترەوە فلتەر کرا.
سایتۆمێتری لێشاو. ڕیزکردنی خانەکان لە پلەی گەرمی 4 پلەی سەدی بە بەکارهێنانی ئامێری FACSAria III (BD Biosciences) و نەرمەکاڵای FACSDiva (BD Biosciences، وەشانی 8.0.1) ئەنجامدرا. هەڵپەسێردراوی خانەکە بە بەکارهێنانی نۆزڵی 100 میکرۆمتر لە ژێر پەستانی 20 psi بە ڕێژەی ~2800 ڕووداو/چرکە ڕیزکرا. بەو پێیەی پێوەرە تەقلیدییەکانی دەروازەکردن (قەبارەی خانە، جیاکاری دوو شێوازی، و تایبەتمەندیەکانی پەرشوبڵاو) ناتوانن دڵنیابن لە جیاکردنەوەی دروستی PN لە جۆرەکانی تری خانە، ستراتیژی دەروازەکردن لەسەر بنەمای بەراوردکردنی ڕاستەوخۆی چڕی YFP و ئۆتۆفلۆرۆسەنس لە mitoYFP+ ​​و مشکی کۆنترۆڵکراوی mitoYFP − دادەنرێت. YFP بە تیشکدانەوە بە نمونەکە بە هێڵی لەیزەری 488 نانۆمەتر وروژێنرێت، و سیگناڵەکە بە بەکارهێنانی فلتەری پاسی باند 530/30 نانۆمەتر دەستنیشان دەکرێت. لە مشکەکانی mitoYFP+، هێزی ڕێژەیی جینی پەیامنێری Rosa26-mitoYFP هەروەها بەکاردەهێنرێت بۆ جیاکردنەوەی جەستەی دەمارەکان و پارچە ئەکسۆنەکان. 7-AAD بە لەیزەرێکی زەردی 561 نانۆمەتر وروژێنراوە و بە فلتەری باند پاسی 675/20 نانۆمەتر دەستنیشان دەکرێت بۆ دەرکردنی خانە مردووەکان. بۆ ئەوەی ئەستێرەخانەکان لە هەمان کاتدا جیا بکرێتەوە، هەڵپەسێردراوی خانەکە بە ACSA-2-APC ڕەنگ کرا، پاشان نمونەکە بە هێڵی لەیزەری 640 نانۆمەتر تیشک درا، و فلتەری 660/20 نانۆمەتر باند پاس بەکارهات بۆ دیاریکردنی سیگناڵەکە.
خانە کۆکراوەکان بە سەنتەرفۆجکردن (1110 خولەک لە خولەکێکدا، 5 خولەک، 4 پلەی سەدی) گوللە کران و لە پلەی گەرمی -80 پلەی سەدی هەڵگیران تا بەکارهێنان. مشکی Mfn2cKO و بەچکە زبڵەکانیان لە هەمان ڕۆژدا پۆلێن دەکرێن بۆ کەمکردنەوەی گۆڕانی ڕێکارەکان. پێشکەشکردن و شیکاری داتاکانی FACS بە بەکارهێنانی نەرمەکاڵای FlowJo (FlowJo LLC، Ashland، Oregon، USA) ئەنجامدرا.
وەک لە سەرەوە باسمان کرد (59)، PCR لە کاتی ڕاستەقینەدا بەکاردەهێنرێت بۆ جیاکردنەوەی DNA لە دەمارە ڕیزکراوەکان بۆ ژماردنی mtDNAی دواتر. هێڵکاری و هەستیاری ئاست لە سەرەتادا بە بەڕێوەبردنی qPCR لەسەر ژمارەی جیاوازی خانەکان تاقیکرایەوە. بە کورتی، 300 PN لەناو بافەرێکی لایزەکردندا کۆبکەرەوە کە پێکهاتووە لە 50 میلی مۆلی تریس-HCl (pH 8.5)، 1 میلی مۆلی EDTA، 0.5% توین 20 و پرۆتیناز K (200 نانوگرەم/میلی لیتر) و لە پلەی گەرمی 55 پلەی سەدی بۆ ماوەی 120 خولەک کەرەوز بکە. خانەکان زیاتر لە پلەی گەرمی 95 پلەی سەدی بۆ ماوەی 10 خولەک کەرەوز کران بۆ دڵنیابوون لە ناچالاکبوونی تەواوەتی پرۆتیناز K. بە بەکارهێنانی پشکنەری TaqMan (Thermo Fisher) تایبەت بە mt-Nd1، mtDNA بە PCRی نیمچە چەندایەتی لە سیستەمی 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific) پێوانە کرا. زانست، ژمارەی کەتەلۆگ Mm04225274_s1)، mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific، ژمارەی کەتەلۆگ AIVI3E8) و 18S (Thermo Fisher Scientific، ژمارەی کەتەلۆگ Hs99999901_s1) جینەکان.
ئامادەکردنی نمونەی پرۆتیۆم. بە گەرمکردنی گیراوەکە لە پلەی گەرمی 95 پلەی سەدی بۆ ماوەی 10 خولەک و دەنگی، لە ناو بافەری لایز [6 M گوانیدین کلۆرید، 10 میلی مۆلی تریس (2-کاربۆکسی ئیتیل) فۆسفین هایدرۆکلۆرید، 10 میلی مۆلی کلۆرۆئەسیتامید و 100 میلی مۆلی تریس-لایز گوللەی دەمارە بەستووەکان لە HCl]. لەسەر Bioruptor (Diagenode) بۆ ماوەی ١٠ خولەک (٣٠ چرکە پەستانی خوێن / ٣٠ چرکە ماوەی وەستان). نمونەکە بە ڕێژەی 1:10 لە 20 میلی مۆلی تریس-HCl (pH 8.0) شلکرایەوە، لەگەڵ 300 نانوگرەم زێڕی تریپسین (Promega) تێکەڵکرا، و بۆ ماوەی شەوێک لە پلەی گەرمی 37 پلەی سەدیدا کەرەوزکرا بۆ بەدەستهێنانی هەرسکردنی تەواو. لە ڕۆژی دووەمدا نمونەکە لە ٢٠ هەزار گم بۆ ماوەی ٢٠ خولەک سەنتەرفۆج کرا. شلەی سەرەوە بە ترشی فۆرمیک 0.1% شلکرایەوە، و گیراوەکە بە StageTips ی خۆدروستکراو خوێی لێکرایەوە. نمونەکە لە ئامێری SpeedVac (Eppendorf concentrator plus 5305) لە پلەی گەرمی 45°C وشککرایەوە، و پاشان پێپتیدەکە لە 0.1% ترشی فۆرمیکدا هەڵواسرا. هەموو نموونەکان لە یەک کاتدا لەلایەن هەمان کەسەوە ئامادەکراون. بۆ شیکردنەوەی نمونەکانی ئەستێرەخانەکان، 4 میکرۆگرام پێپتیدی بێ خوێ بە تاگی بارستەی تاندێم (TMT10plex، ژمارەی کەتەلۆگ 90110، Thermo Fisher Scientific) بە ڕێژەی پێپتید بۆ کاراکتەری TMT 1:20 ناوزەد کرا. بۆ نیشاندانی TMT، 0.8 میلیگرام کاراکتەری TMT لە 70 میکرۆلیتر ACNی بێ ئاودا هەڵواسرایەوە، و پێپتیدی وشککراوە پێکهێنرایەوە بۆ 9 میکرۆلیتر 0.1 M TEAB (ترای ئیتیلئەمۆنیۆم بیکاربۆنات)، کە 7 میکرۆلیتر کاراکتەری TMT لە ACNدا زیادکرا. چڕبوونەوەکە 43.75% بووە. دوای 60 خولەک لە کەرەوزکردن، کارلێکەکە بە 2 میکرۆلیتر 5% هایدرۆکسیلامین کوژێنرایەوە. پێپتیدە نیشانەکراوەکان کۆکرانەوە، وشککرانەوە، لە 200 میکرۆلیتر ترشی فۆرمیک 0.1% (FA)دا هەڵواسران، دابەشکران بۆ دوو، و پاشان بە بەکارهێنانی StageTips کە خۆدروستکراون خوێیان لێکرایەوە. بە بەکارهێنانی کرۆماتۆگرافی شلەی کارایی بەرزی UltiMate 3000 (کرۆماتۆگرافی شلەی کارایی بەرزی UltiMate 3000)، یەکێک لە دوو نیوەکە لەسەر ستوونی کرۆماتۆگرافی Acquity 1mm x 150mm کە پڕکرابوو لە گەردیلەکانی 130Å1.7μm C18 بەشکرا (Waters، ژمارەی کەتەلۆگ SKU: 186006935). تێرمۆ فیشەر زانستی). پێپتیدەکان جیا بکەرەوە بە ڕێژەی لێشاوی 30μl/min، جیا بکەرەوە لە 1% بۆ 50% بافەر B بۆ ماوەی 85 خولەک بە هەنگاو بە هەنگاو گرادێنت 96 خولەک، لە 50% بۆ 95% بافەر B بۆ ماوەی 3 خولەک، پاشان 8 خولەک بۆ 95 % بافەر B؛ بافەر A 5% ACN و 10 mM ئەمۆنیۆم بیکاربۆنات (ABC)، و بافەر B 80% ACN و 10 mM ABC یە. هەر ٣ خولەک جارێک بەشەکان کۆبکەرەوە و بیکە بە دوو گروپ (١ + ١٧، ٢ + ١٨ و هتد) و لەناو سەنتەرفۆجی بۆشاییدا وشکیان بکەرەوە.
شیکاری LC-MS/MS. بۆ سپێکترۆمێتری بارستەیی، پێپتیدەکان (ژمارە r119.aq) لەسەر ستوونی شیکاری PicoFrit 25 سم، تیرەی ناوەوەی 75 میکرۆمتر جیاکرانەوە (عەدەسەی ئامانجی نوێ، ژمارەی بەشەکانی PF7508250) کە بە 1.9 میکرۆمتر ReproSil-Pur 120 C18-AQ medium (Dr. Maisch, mat) تەیارکرابوو، بە بەکارهێنانی EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific، ئەڵمانیا). ستوونەکە لە پلەی گەرمی 50 پلەی سەدیدا ڕاگیرا. بافەرەکانی A و B بە ڕێککەوت 0.1% ترشی فۆرمیک لە ئاودا و 0.1% ترشی فۆرمیک لە 80% ACN. پێپتیدەکان لە 6% بۆ 31% بافەر B بۆ ماوەی 65 خولەک و لە 31% بۆ 50% بافەر B بۆ ماوەی 5 خولەک جیاکرانەوە بە گرادێنتێکی 200 nl/min. پێپتیدە شۆردراوەکان لەسەر سپێکترۆمێتری بارستەیی ئۆربیتراپ فیوژن (Thermo Fisher Scientific) شیکرانەوە. پێوانەکردنی پێشەکی پێپتید m/z بە ڕوونی 120,000 لە مەودای 350 بۆ 1500 m/z ئەنجام دەدرێت. بە بەکارهێنانی وزەی پێکدادانی ئاساییکراوی 27%، بەهێزترین پێشەکی کە دۆخی بارگەی 2 بۆ 6 هەڵدەبژێردرێت بۆ بڕینی وزەی بەرزی جیابوونەوەی تەڵەی C (HCD). کاتی خولەکە بە 1 s دانراوە. بەهای m/z ی پارچە پێپتیدەکە لە تەڵەی ئایۆنەکەدا پێوانە کرا بە بەکارهێنانی بچووکترین ئامانجی AGC کە 5×104 بوو و زۆرترین کاتی دەرزی لێدان 86 میلی سێکانت بوو. دوای پارچەپارچەبوون، پێشەکییەکە بۆ ماوەی 45 چرکە لە لیستی دەرکردنی داینامیکی دانرا. پێپتیدەکانی TMT-نیشانەی لەسەر ستوونی 50 سم، 75 میکرۆمتری Acclaim PepMap جیاکرانەوە (Thermo Fisher Scientific، ژمارەی کەتەلۆگ 164942)، و سپێکتری کۆچکردن لەسەر سپێکترۆمێتری بارستەیی Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) شیکرایەوە کە بە ئامێری ئایۆنەکانی شەپۆلی ناهاوسەنگی مەیدانی بەرز (FAIMS) تەیارکرابوو (Thermo Fisher Scientific) بە دوو ڤۆڵتیەی قەرەبووکردنەوە کە -50 و -70 V کاردەکات. MS3 کە لەسەر بنەمای پێشەکی هاوکاتکردن هەڵبژێردراوە بۆ پێوانەکردنی سیگناڵی ئایۆنی ڕاپۆرتی TMT بەکاردەهێنرێت. جیاکردنەوەی پێپتید لەسەر EASY-nLC 1200 ئەنجامدرا، بە بەکارهێنانی 90% شۆردنی هێڵی گرادێنت، لەگەڵ چڕیی بافەر لە 6% بۆ 31%؛ بافەر A 0.1% FA بوو، و بافەر B 0.1% FA و 80% ACN بوو. ستوونی شیکاری لە پلەی گەرمی 50 پلەی سەدی کاردەکات. بەکارهێنانی FreeStyle (وەشان 1.6، Thermo Fisher Scientific) بۆ دابەشکردنی فایلە ئەسڵییەکە بەپێی ڤۆڵتیەی قەرەبووکردنەوەی FAIMS.
ناسینەوە و ژماردنی پڕۆتین. بە بەکارهێنانی بزوێنەری گەڕانی یەکگرتووی ئەندرۆمێدا، داتا سەرەتاییەکان بە بەکارهێنانی وەشانی MaxQuant 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) شیکرانەوە. جگە لە زنجیرەکانی Cre recombinase و YFP کە لە Aequorea victoria وەرگیراون، سپێکتری پارچەی پێپتید بۆ زنجیرەی کانۆنی و زنجیرەی ئایزۆفۆڕمی پرۆتۆئۆمی ئاماژەی مشک گەڕێندرا (Proteome ID UP000000589، کە لە UniProt لە مانگی ئایاری 2017 دابەزێندرا). ئۆکساندنی میتیۆنین و ئەسیتولاسیۆنی پڕۆتینی N-کۆتایی وەک گۆڕانکاری گۆڕاو دانران؛ سیستئین کاربامۆیل میتیلاسیۆن وەک گۆڕانکاری جێگیر دانرا. پارامێتەرەکانی هەرسکردن لەسەر "تایبەتمەندی" و "تریپسین/P" دانراون. کەمترین ژمارەی پێپتید و پێپتیدی ڕیشتاشی کە بۆ ناسینەوەی پڕۆتین بەکاردەهێنرێن ١؛ کەمترین ژمارەی پێپتیدە تایبەتەکان 0. لە ژێر بارودۆخی هاوتاکردنی نەخشەی پێپتیدەکاندا، ڕێژەی ناسینەوەی پڕۆتینەکان 0.01 بوو. بژاردەی “Second Peptide” چالاک کراوە. بژاردەی “match between runs” بەکاربهێنە بۆ گواستنەوەی ناسنامە سەرکەوتووەکان لە نێوان فایلە ڕەسەنە جیاوازەکاندا. ژمارەی کەمترین ڕێژەی LFQ 1 بەکاربهێنە بۆ ژماردنی بێ لیبێڵ (LFQ) (60). چڕی LFQ بۆ لانیکەم دوو بەهای ڕەوا لە لانیکەم یەک گروپی جینۆتایپدا لە هەر خاڵێکی کاتییدا فلتەر دەکرێت، و لە دابەشکردنێکی ئاساییەوە دەرهێنراوە بە پانایی. 0.3 و 1.8 بەرەو خوارەوە. بۆ شیکردنەوەی ئەنجامەکانی LFQ پلاتفۆرمی کۆمپیوتەری Perseus (https://maxquant.net/perseus/) و R (https://r-project.org/) بەکاربهێنە. تاقیکردنەوەی دوولایەنەی t مامناوەند لە پاکێجی نەرمەکاڵای لیما بۆ شیکاری دەربڕینی جیاواز بەکارهات (61). شیکاری داتاکانی گەڕان بە بەکارهێنانی ggplot، FactoMineR، factoextra، GGally و pheatmap ئەنجام دەدرێت. داتاکانی پرۆتۆمیکس لەسەر بنەمای TMT بە بەکارهێنانی MaxQuant وەشانی 1.6.10.43 شیکرانەوە. گەڕان بەدوای داتای پرۆتۆمیکی خاو لە بنکەدراوەی پرۆتۆمیکی مرۆیی یونیپرۆت، کە لە ئەیلوولی ٢٠١٨ دابەزێنراوە. شیکارییەکە فاکتەری ڕاستکردنەوەی پاکی ئایزۆتۆپ لەخۆدەگرێت کە لەلایەن بەرهەمهێنەرەوە دابینکراوە. بۆ شیکاری دەربڕینی جیاوازی لیما لە R بەکاربهێنە. داتا ڕەسەنەکان، ئەنجامی گەڕانی بنکەدراوە، و کاری شیکاری داتا و ئەنجامەکان هەموویان لە هاوپەیمانی ProteomeXchange لە ڕێگەی کۆگای هاوبەشی PRIDE لەگەڵ ناسێنەری کۆمەڵە داتا PXD019690 هەڵدەگیرێن.
تێبینییە کاراییەکان شیکارییەکە دەوڵەمەند دەکەن. ئامرازی شیکاری ڕێڕەوی داهێنەر (QIAGEN) بەکارهات بۆ دیاریکردنی دەوڵەمەندی زاراوەی تێبینی کارایی کۆمەڵە داتاکان لە 8 هەفتەدا (شێوەی 1). بە کورتی، لیستی پڕۆتینی چەندایەتی کە لە شیکاری داتاکانی LC-MS/MS (سپێکترۆمێتری بارستەیی تاندێم) بەدەست هاتووە بەم پێوەرە فلتەرانەی خوارەوە بەکاردەهێنرێت: Mus musculus وەک جۆر و پاشخان هەڵدەبژێردرێت، و پۆلەکە بەهای P نیشان دەدات کە لەلایەن Benjamini ڕێکخراوە بۆ دەوڵەمەندکردنی 0.05 یان کەمتر بە گرنگ دادەنرێت. بۆ ئەم گرافە، پێنج پۆلی زیادەی سەرەوە لە هەر پۆلێکدا بە پشتبەستن بە بەهای P ڕێکخراو نیشان دراون. بە بەکارهێنانی چەندین تاقیکردنەوەی t، بە بەکارهێنانی بەرنامەی دوو قۆناغی بەرزکردنەوەی هێڵی بنیامینی، کریگەر و یکوتیێلی (Q = 5%)، شیکاری دەربڕینی پڕۆتینی کات-کۆرس لەسەر کاندیدە گرنگەکان ئەنجام دەدرێت کە لە هەر پۆلێکدا دەستنیشانکراون، و هەر ڕیزێک بە جیا شیکاری دەکرێت. پێویست ناکات SD ی بەردەوام وەربگیرێت.
بۆ ئەوەی ئەنجامەکانی ئەم توێژینەوەیە لەگەڵ بنکەدراوە بڵاوکراوەکان بەراورد بکەین و دیاگرامی ڤێن لە وێنەی 1دا دروست بکەین، ئێمە لیستی پڕۆتینی چەندایەتیمان لەگەڵ تێبینییەکانی میتۆکارتا 2.0 تێکەڵ کرد (24). بۆ دروستکردنی دیاگرامەکە ئامرازی ئۆنلاین Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) بەکاربهێنە.
بۆ زانیاری ورد لەسەر ڕێکارە ئامارییەکان کە بۆ شیکاری پرۆتۆمیکس بەکاردەهێنرێن، تکایە سەردانی بەشی هاوبەشی کەرەستە و شێوازەکان بکەن. بۆ هەموو تاقیکردنەوەکانی تر، دەتوانرێت زانیاری ورد لە ئەفسانەی هاوبەشدا بدۆزرێتەوە. مەگەر بە پێچەوانەوە دیاری نەکرێت، هەموو داتاکان بە شێوەی مامناوەندی ± SEM دەربڕدراون، و هەموو شیکارییە ئامارییەکان بە بەکارهێنانی نەرمەکاڵای GraphPad Prism 8.1.2 ئەنجامدراون.
بۆ زانیاری تەواوکەر بۆ ئەم بابەتە، تکایە سەیری http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 بکەن
ئەمە بابەتێکی دەستڕاگەیشتنێکی کراوەیە کە بەپێی مەرجەکانی مۆڵەتی ئیسباتکردنی کرێتیڤ کۆمۆن-نابازرگانی دابەشکراوە، کە ڕێگە بە بەکارهێنان و دابەشکردن و دووبارە بەرهەمهێنانەوە دەدات لە هەر میدیایەکدا، بە مەرجێک بەکارهێنانی کۆتایی بۆ قازانجی بازرگانی نەبێت و پێشمەرجەکە ئەوەیە کە کارە ڕەسەنەکە ڕاست بێت. سەرچاوە.
تێبینی: تەنها داوات لێدەکەین ناونیشانی ئیمەیڵەکەت بدەیت بۆ ئەوەی ئەو کەسەی پێشنیاری دەکەیت بۆ پەیجەکە بزانێت کە تۆ دەتەوێت ئیمەیڵەکە ببینێت و سپام نییە. ئێمە هیچ ناونیشانێکی ئیمەیڵ ناگرین.
ئەم پرسیارە بەکاردێت بۆ تاقیکردنەوەی ئەوەی کە ئایا تۆ سەردانکەریت و ڕێگریکردن لە ناردنی سپام بە شێوەیەکی ئۆتۆماتیکی.
لەلایەن ئی.مۆتۆری، ئی.ئاتاناسۆڤ، ئێس ئێم ڤی کۆچان، ک.فۆڵز-دۆناهوێ، ڤ.ساکتیڤێلو، پ.جیاڤالیسکۆ، ن.تۆنی، ج.پویال، ن.-جی. لارسۆن
شیکاری پرۆتیۆمیکی دەمارە ناکارامەکان دەریخست کە بەرنامەکانی گۆڕانکاری چالاک دەکرێن بۆ بەرپەرچدانەوەی تێکچوونی دەمارەکان.
لەلایەن ئی.مۆتۆری، ئی.ئاتاناسۆڤ، ئێس ئێم ڤی کۆچان، ک.فۆڵز-دۆناهوێ، ڤ.ساکتیڤێلو، پ.جیاڤالیسکۆ، ن.تۆنی، ج.پویال، ن.-جی. لارسۆن
شیکاری پرۆتیۆمیکی دەمارە ناکارامەکان دەریخست کە بەرنامەکانی گۆڕانکاری چالاک دەکرێن بۆ بەرپەرچدانەوەی تێکچوونی دەمارەکان.
©2020 کۆمەڵەی ئەمریکی بۆ پێشخستنی زانست. هەموو مافەکان پارێزراوە. AAAS هاوبەشی کۆمپانیاکانی HINARI، AGORA، OARE، CHORUS، CLOCKSS، CrossRef و COUNTER ە. زانستی پێشکەوتن ISSN 2375-2548.