ئێستا†ناونیشانی ئێستا: OX11 0DE، بەریتانیا، بینای ئەڵماس، پارکی زانست و داهێنانی هاروێڵ، دایتکۆت، ئۆکسفۆردشایر، بەریتانیا، کۆمپانیای سەرچاوەی ڕووناکی ئەڵماس، لیندەد، سەنتەری وێنەگرتنی بایۆلۆجی ئەلیکترۆنی.
کۆمپلێکسی کۆکردنەوەی ڕووناکی ناوەندی کارلێککردن 1 (RC-LH1) پێکهاتەی سەرەکی فۆتۆسێنتێزی بەکتریا فۆتۆتڕۆفیکی وەنەوشەییە. ئێمە دوو پێکهاتەی مایکرۆسکۆپی کرایۆ-ئەلکترۆنیمان لە کۆمپلێکسی RC-LH1 لە Rhodopseudomonas palustris ناساند. پێکهاتەی ڕوونی 2.65-Å ی کۆمپلێکسی RC-LH114-W پێکهاتووە لە 14 لوپی ژێر یەکەیی LH1 کە دەوری RC داوە، کە بەهۆی پڕۆتینی W دەبڕدرێت، لە کاتێکدا کۆمپلێکسەکە بەبێ پڕۆتین-W پێکهاتەی RC یە کە بە RC دەورە دراوە. داخراو 16 ژێر یەکە LH1 لوپ. بەراوردکردنی ئەم پێکهاتانە تێڕوانینێک دەدات بۆ داینامیکی کوینۆن لە کۆمپلێکسی RC-LH1، لەوانەش گۆڕانکارییە کۆنفۆڕماسیۆنییەکانی پێشتر دیارینەکراو لە کاتی بەستنەوەی کوینۆن لە شوێنی RC QB، هەروەها شوێنی شوێنەکانی بەستنەوەی کوینۆنی یارمەتیدەر، کە یارمەتی گواستنەوەیان دەدەن بۆ RC. پێکهاتەی ناوازەی پڕۆتینی W ڕێگری دەکات لە داخستنی لوپی LH1، بەمەش کەناڵێک بۆ خێراکردنی ئاڵوگۆڕی کوینۆن/کوینۆلۆن دروست دەکات.
ئەو وزەیەی کە لەلایەن فۆتۆسێنتێزەوە دابین دەکرێت دەتوانێت نزیکەی هەموو ژیانی سەر زەوی بپارێزێت، هەروەها توانایەکی زۆری هەیە بۆ بایۆتەکنەلۆژیای خۆر. لە کاتێکدا کە فۆتۆسێنتێزی جیهانی بەرەوپێش دەبات، بەکتریا فۆتۆتڕۆفیکەکانی وەنەوشەیی شێوازی وزەی جۆراوجۆر و توانای گۆڕانکاری خۆراکیش نیشان دەدەن. دەتوانن خۆیان لە فۆتۆسێنتێز بەدوور بگرن و وەک بەکتریا هێتێرۆتڕۆفیکەکان لە تاریکیدا گەشە بکەن، دەتوانن نایترۆجین و دووەم ئۆکسیدی کاربۆن جێگیر بکەن و هایدرۆجین بەرهەم بهێنن و پێکهاتە بۆنخۆشەکان تێکبدەن (1-3). بۆ ئەوەی وزە بۆ ئەم پرۆسانە دابین بکرێت، پێویستە ڕووناکی بە خێرایی و کارا بگۆڕدرێت بۆ وزەی کیمیایی. ئەم پرۆسەیە کاتێک دەست پێدەکات کە کۆمپلێکسی ئەنتێنەی ڕووناکی گیرفان ڕووناکی هەڵدەمژێت و وزەی گیرخواردوو دەگوازێتەوە بۆ ناوەندی کارلێککردن (RC)، بەمەش جیاکردنەوەی بارگە دەست پێدەکات (4-7). یەکەی بنەڕەتی فۆتۆسێنتێز لە بەکتریا فۆتۆتڕۆفی وەنەوشەییەکان لە جۆری ٢ RC پێکهاتووە، کە بە کۆمپلێکسی کۆکردنەوەی ڕووناکی ١ (LH1) دەورە دراوە، کە کۆمپلێکسی ناوەکی RC-LH1 پێکدەهێنێت. LH1 لە لایەن کۆمەڵێک هێتێرۆدایمەری αβ کێشراوەوە دروست دەبێت، کە هەریەکەیان دوو مۆلیکولی کلۆرۆفیلی بەکتریا (BChl) a و یەک یان دوو کارۆتینۆید دەبەستێتەوە (8-12). سادەترین ئەنتێنەی LH1 پێکدێت لە 16 یان 17 هێتێرۆدایمەری αβ کە دەوری RC (9-13) دەدەن لە لوپێکی داخراودا، بەڵام لە کۆمپلێکسەکانی ناوەکی تردا، پێپتیدەکانی ترانزەمێمبرین بەردەوامی LH1 ی دەوروبەر دەبڕن، بەم شێوەیە بڵاوبوونەوەی کوینۆڵ/کوینۆن لە نێوان RC و کۆمپلێکسی سایتۆکرۆمی bc1 بەرەوپێش دەبەن (11، 13-15). ڕووەکی فۆتۆتڕۆفی وەنەوشەیی Rhodopseudomonas (Rps.) زیندەوەری نمونەییە کە دەتوانێت لە وزە و گواستنەوەی ئەلکترۆن تێبگات کە پشتگیری لە فۆتۆسێنتێز دەکات. یەکەم پێکهاتەی بلوری Rps. مۆدێلی کۆمپلێکسی پالوستریس RC-LH1 بریتییە لە RC، کە بە 15 لوپی LH1ی هێتێرۆدایمێریک دەورە دراوە، کە بەهۆی پڕۆتینێکی نەناسراوەوە بە ناوی "پڕۆتینی W" دەبڕدرێت (14). دواتر پڕۆتینی-W وەک RPA4402 دەستنیشانکرا، کە پڕۆتینێکی 10.5kDa تایبەتمەند نییە کە سێ هێلیسی پێشبینیکراوی ترانزەمێمبرین (TMH)ی هەیە (16). ئێمە پێشنیار دەکەین ناوی جینی rpa4402 کۆدکردنی پڕۆتینی W بگۆڕین بۆ pufW بۆ ئەوەی لەگەڵ ناونانی بەکارهێنراو بۆ جینەکانی کۆدکردنی ژێر یەکەکانی RC-L، M (pufL، pufM) و LH1α، β (pufA، pufB) بگونجێت. ئەوەی جێگای سەرنجە، پڕۆتینی-W تەنها لە نزیکەی 10%ی RC-LH1دا هەیە، ئەمەش Rps ئاشکرا دەکات. palustris دوو کۆمپلێکسی جیاوازی RC-LH1 بەرهەم دەهێنێت. لێرەدا، ئێمە پێکهاتەکانی کرایۆ-EM (cryo-EM)ی ڕوونی بەرزی دوو کۆمپلێکسی ناوەکی ڕاپۆرت دەکەین، یەکێکیان بە پڕۆتینی W و 14 αβ هێتێرۆدایمەر، ئەوی دیکەیان بەبێ پڕۆتینی W و هەلۆکی داخراو 16 هێتێرۆدایمەر LH1. پێکهاتەکەمان نوێنەرایەتی گۆڕانکارییەکی هەنگاوی دەکات لە تێگەیشتن لە کۆمپلێکسی RC-LH1 ی Rps. palustris، چونکە ئێمە دانیشتوانی هاوشێوەی هەر جۆرێکمان شیکردووەتەوە و ڕوونییەکی تەواومان هەیە بۆ ئەوەی بە ڕوونی هەر پێپتیدێک و ڕەنگە بەستراوەکان و چەوری و کوینۆنەکانی پەیوەندیدار دیاری بکەین. بەراوردکردنی ئەم پێکهاتانە نیشان دەدات کە سێ پڕۆتینی TMH-W کە تا ئێستا لە هیچ کۆمپلێکسێکی تری RC-LH1دا نەدۆزراونەتەوە کەناڵێکی کوینۆن دروست دەکەن بۆ خێراکردنی ئاڵوگۆڕی کوینۆن/کوینۆلۆن. ژمارەیەک لە شوێنی بەستنەوەی چەوری و کوینۆنی پارێزراو دەستنیشان کراون، و ئێمە گۆڕانکارییەکی نوێی کۆنفۆڕماسیۆنمان ئاشکرا کردووە دوای تێکەڵکردنی کوینۆن و RC، کە ڕەنگە گونجاو بێت بۆ فۆتۆسیستەمی II (PSII) RC ی زیندەوەرە فۆتۆتڕۆفیکە ئۆکسجیندارەکان. دۆزینەوەکانمان تێڕوانینێکی نوێ لە جووڵەی بەستنەوە و ئاڵوگۆڕی کوینۆن/کوینۆلۆن لە کۆمپلێکسی ناوەکی RC-LH1ی بەکتریا فۆتۆتڕۆفیکی وەنەوشەییەکان دەدەن.
بە مەبەستی ئاسانکاری بۆ لێکۆڵینەوەیەکی ورد لە دوو کۆمپلێکسەکە کە لە Rps. palustris، ئێمە هەر RC-LH1 بە ڕێگەی بایۆکیمیایی جیا دەکەینەوە. کۆمپلێکسی کەمیی پڕۆتینی W (لەمەودوا بە ΔpufW ناودەبرێت) لە جۆری کەمیی جینی pufW پاککرایەوە (16)، و تەنها یەک کۆمپلێکسی RC-LH1 دەتوانرێت بەرهەمبهێنرێت. کۆمپلێکسی پڕۆتینی W کە پێکهاتووە لە لایەن جۆرێکەوە بەرهەم دێت. پڕۆتینی W ئەم جۆرە بە تاگی 10x His لە کۆتایی C ی خۆیدا دەستکاری دەکرێت، بەجۆرێک کە کۆمپلێکسی پڕۆتینی W ی تێدایە بە شێوەیەکی کاریگەر لەگەڵ زۆربەی پڕۆتینی W کەمدا تێکەڵ بکرێت بە بێ جووڵەکردنی کانزا. کۆمپلێکسەکە بە شێوەیەکی کاریگەر جیاکراوەتەوە (16) کرۆماتۆگرافی نزیکایەتی (IMAC).
وەک لە وێنەی 1 دا نیشان دراوە، هەردوو کۆمپلێکسەکە سێ یەکەی لاوەکی RC (RC-L، RC-M و ​​RC-H)یان تێدایە کە بە ئەنتێنەی LH1 دەورە دراوە. پێکهاتەی 2.80-A ی کۆمپلێکسەکە کە پڕۆتینی-Wی نییە 16 هێتێرۆدایمەری αβ نیشان دەدات، کە لوپێکی داخراوی LH1 پێکدەهێنێت کە بە تەواوی دەوری RC داوە، لەمەودوا بە کۆمپلێکسی RC-LH116 ناودەبرێت. پێکهاتەی 2.65Åی کۆمپلێکسی پڕۆتین-W-پێکهاتوو 14-هیترۆدایمەر LH1ی هەیە کە لەلایەن پڕۆتین-W پچڕاوە، لەمەودوا بە RC-LH114-W ناودەبرێت.
(A و B) نوێنەرایەتی ڕووی ئاوێتە. (C و D) ڕەنگە بەستراوەکان کە بە داری دەربڕدراون. (E و F) ئەو کۆمپلێکسانەی کە لە ڕووی سایتوبڵازمیەوە بینراون، پێپتیدەکان و ژێر یەکەکانی LH1 یان هەیە کە لە کارتۆنەکاندا نیشان دراون، و ژمارەیان بە ئاراستەی کاتژمێر لە بۆشایی پڕۆتین-W [کە لەگەڵ ژمارەدانانی Rba یەکدەگرێتەوە. کۆمپلێکسی سپایرۆیدەکان (13)]. بۆ LH1-α، ڕەنگی ژێر یەکەی پڕۆتین زەردە؛ بۆ LH1-β، ڕەنگی ژێر یەکەی پڕۆتین شینە؛ بۆ پڕۆتینی-W، پڕۆتینەکە سوورە؛ بۆ RC-H، ئەوە سیانەیە؛ بۆ RC-L، ئەوە پرتەقاڵییە؛ بۆ RC-M، مەجنتا. هاوفاکتەرەکان بە داری نیشان دەدرێن، سەوز نوێنەرایەتی مۆلیکولەکانی BChl و BPh a دەکات، وەنەوشەیی نوێنەرایەتی کارۆتینۆیدەکان دەکات، و زەرد نوێنەرایەتی مۆلیکولەکانی UQ10 دەکات. (G و H) دیمەنی گەورەکراوی بۆشایی پڕۆتین-W لە ناوچەی هاوتای کۆمپلێکسی RC-LH114-W (G) و کۆمپلێکسی RC-LH116 (H). کۆفاکتەرەکان لە شێوەی پڕکردنەوەی بۆشاییدا پیشان دەدرێن، کوینۆنی کیلێت بە ڕەنگی شین پیشان دەدرێت. بۆشایی پڕۆتین-W بە هێڵی خاڵی شین لە (G)دا تیشک خراوەتە سەر، و ئەو کونە بچووکانەی کە کوینۆن/کوینۆلۆڵ تێیدا بڵاودەبێتەوە لەسەر ئەڵقەی LH116 بە هێڵێکی خاڵی ڕەش لە (H)دا تیشک خراوەتە سەر.
وێنەی 1 (A و B) RC نیشان دەدات کە بە ڕیزبەندی کراوە یان داخراو لە هێتێرۆدایمەرەکانی LH1αβ دەورە دراوە، کە هەریەکەیان دوو BChl و یەک کارۆتینۆید دەبەستنەوە (شێوەی 1، C و D). توێژینەوەکانی پێشوو دەریانخستووە کە Rps کۆمپلێکسی LH1 ە. لە ڕێڕەوی بایۆسێنتێزی سپیرولینا زانتین، ئەم جۆرانە دانیشتوانی تێکەڵاوی کارۆتینۆیدەکانیان تێدایە (17). بەڵام سپیرۆپیرۆکسانتین کارۆتینۆیدی باڵادەستە و چڕییەکەی جێگەی ڕەزامەندییە. بۆیە، ئێمە هەڵمانبژارد بۆ مۆدێلکردنی سپیرۆکسانتین لە هەموو شوێنەکانی بەستنەوەی LH1. پۆلیپێپتیدی ئەلفا و بێتا تاکە TMHن کە ناوچەی دەرەوەی پەردەی کورتیان هەیە (شێوەی 1، A، B، E، و F). هەرچەندە چڕی 17 پاشماوە لە کۆتایی Cدا بەدی نەکرا، بەڵام پۆلیپێپتیدی ئەلفا لە Met1 بۆ Ala46 لە هەردوو کۆمپلێکسەکەدا جیاکرایەوە. پۆلیپێپتیدی β لە Gly4 بۆ Tyr52 لە RC-LH116 کەم بووەوە، و لە Ser5 بۆ Tyr52 لە RC-LH114-W. هیچ چڕییەکی 3 یان 4 N-کۆتایی یان 13 C-کۆتایی پاشماوە بەدی نەکرا (شێوەی S1). شیکاری سپێکترۆمێتری بارستەیی کۆمپلێکسی تێکەڵاوی RC-LH1 کە لە جۆری کێوی ئامادەکراوە دەریخست کە ناوچەی ونبوو لە ئەنجامی بڕینی جیاوازی ئەم پێپتیدانە بووە (شێوەی S1 و S2). هەروەها فۆرمیلاسیۆنی N-کۆتایی α-Met1 بینرا (f). شیکارییەکە دەریخست کە α-پێپتید پێکهاتووە لە پاشماوەی fMet1 تا Asp42/Ala46/Ala47/Ala50، و β-پێپتید پێکهاتووە لە پاشماوەی Ser2 تا Ala53، کە لەگەڵ نەخشەی چڕی EM پلەی گەرمی نزمدا ڕێککەوتووە.
هەماهەنگی α-His29 و β-His36 وا دەکات BChls ڕووبەڕووی ڕووبەڕوو بێتەوە؛ هەر αβ هێتێرۆدایمەرێک لەگەڵ دراوسێکانی کۆدەبێتەوە بۆ پێکهێنانی هەلۆکێکی کراوە (RC-LH114-W) یان هەلۆکێکی داخراو (RC-LH116) لە دەوری RC ڕیزبەندی ڕەنگی جووتکراوی ئێکسیتۆن (شێوەی 1، C و D). بە بەراورد لەگەڵ باندی 877 نانۆمەتر لە RC-LH114-W، گۆڕانی سووری مژینی 880 نانۆمەتر لە RC-LH116 3 نانۆمەترە (شێوەی 2A). بەڵام سپێکتریمی دوو ڕەنگی بازنەیی نزیکەی وەک یەکە (شێوەی ٢B)، ئەمەش ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە هەرچەندە جیاوازییەکی ڕوون لە نێوان لوپی کراوە و داخراودا هەیە، بەڵام ژینگەی ناوخۆیی BChls زۆر لەیەک دەچێت. ڕەنگە وەرچەرخانی سووری مژینی لە ئەنجامی کەمبوونەوەی جووڵەی گەرمی و زیادبوونی سەقامگیری بێت لەسەر لوپی داخراو (18، 19)، گۆڕانی کۆپڵینگی ڕەنگ کە بەهۆی لوپی داخراوەوە (20، 21)، یان تێکەڵەیەک لەم دوو کاریگەرییە (11).
(A) سپێکتریمی مژینی سەروو بنەوشەیی/بینراو/نزیک ژێر سوور، کە لوتکەکانی بە ڕەنگە هاوتاکانیان نیشانە کراون و ئاسایی کراون بۆ لوتکەی BPh لە 775 نانۆمەتر. (B) سپێکتریمی دوو ڕەنگی بازنەیی ئاسایی کراوەتەوە بۆ مژینی BChl لە 805 نانۆمەتر. (C و D) سپێکتری ΔA هەڵبژێردراو لە سپێکتری مژینی کات-چارەسەرکراوی کۆمپلێکسی RC-LH114-W (C) و کۆمپلێکسی RC-LH116 (D). بۆ بەراوردکردنی باشتر، هەموو سپێکترەکان ئاسایی دەکرێنەوە بۆ ∆A ی −A لە 0.2 ps. (E) ڕێژەی ئۆکساندنی سایتۆکرۆمی c2 دوای تیشکدانەوە لە ئامادەبوونی چڕیی جۆراوجۆری UQ2 (بۆ زانیارییە خاوەکان سەیری وێنەی S8 بکە). (F) لە خانەکانی گەشەکردن لە ژێر ڕووناکی چڕی نزم، مامناوەند یان بەرز (10، 30 یان 300μMm-2 s-1، بە ڕێککەوت)، ژێر یەکەکانی پڕۆتینی W و RC-L لە کۆمپلێکسی پاککراوە و ڕێژەی پەردەی جیاکراوە. ئاستی پڕۆتین بە ئەلکترۆفۆڕێزی جێڵی SDS-polyacrylamide و تاقیکردنەوەی بەرگری دیاری بکە (بۆ زانیارییە خاوەکان سەیری وێنەی S9 بکە). ڕێژەکە بە بەراورد بە کۆمپلێکسی پاککراوەی RC-LH114-W دیاری بکە. ڕێژەی ستۆکیۆمێتری RC-L بۆ پڕۆتین-W ی کۆمپلێکسەکە 1:1 یە.
BChls لە شوێنی 1 لە لوپی αβ14 شێواوی RC-LH114-W (شێوەی 1، A، C، و E) بە 6.8Å لە بەخشەری سەرەتایی RC (P) نزیکترن لە BChls هاوتاکان لە RC-LH116 (شێوەی 1، B، D، و F، و وێنەی S3); بەڵام، جوڵەی مژینی ڕاگوزەری دوو کۆمپلێکسەکە نیشان دەدات کە بۆ RC-LH114-W و RC-LH116، نەگۆڕەکانی کاتی گواستنەوەی وزەی وروژاندن لە LH1 بۆ RC 40 ±4 و 44±3 ps یە (شێوەی 2). ، C و D، وێنەی S4 و خشتەی S2). هەروەها جیاوازییەکی بەرچاو لە گواستنەوەی ئەلیکترۆنی لە ناو RCدا نییە (شێوەی S5 و دەقی تەواوکەری پەیوەندیدار). ئێمە گومانمان هەیە کە یەکسانیی نزیک لە کاتی گواستنەوەی وزە لە نێوان LH1 و RC-P دەگەڕێتەوە بۆ هاوشێوەی مەودا، گۆشە و وزەی پۆتانسێلی زۆربەی BChl لە دوو لوپی LH1. وا دیارە کە گەڕان بەدوای شێوازی وزەی LH1 بۆ گەیشتن بە کەمترین مەودا خێراتر نییە لە گواستنەوەی ڕاستەوخۆی وزە لە شوێنە ژێر گونجاوەکانەوە بۆ RC. هەروەها ڕەنگە هەلۆکی LH1ی لوپی کراوە لە RC-LH114-Wدا جووڵەی گەرمی بێ بایەخ لە ژێر بارودۆخی پلەی گەرمی نزمدا تێپەڕێت بۆ شیکاری پێکهاتەیی، و کۆنفۆڕماسیۆنێکی ئەڵقەی αβ14 درێژتر لە پلەی گەرمی ژووردا هەیە لە مەودای ڕەنگکردنی βBChls لە شوێنی RC 1.
کۆمپلێکسی RC-LH116 32 BChls و 16 کارۆتینۆید لەخۆدەگرێت، و ڕێکخستنی گشتی هەمان ئەو ڕێکخستنەیە کە لە Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9)، Thiorhodovibrio (Trv.) 970 جۆر (PDB ID 7C9R) (12) و سەوز بەدەست هاتووە چڵکن (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). دوای ڕێکخستن، تەنها لادانێکی بچووک لە شوێنی هێتێرۆدایمەرەکانی αβ بینرا، بە تایبەت 1-5، 15، و 16 (شێوەی S6). بوونی پڕۆتینی-W کاریگەرییەکی بەرچاوی لەسەر پێکهاتەی LH1 هەیە. سێ TMH ەکەی بە لوپی کورت بەستراوەتەوە، لەگەڵ کۆتایی N لە لای لومێنی کۆمپلێکسەکە و کۆتایی C لە لایەنی سایتوبڵازمی (شێوەکانی 1A و 3، A تا D). پڕۆتینی-W تا ڕادەیەکی زۆر ئاو فۆبیکە (شێوەی 3B)، و TMH2 و TMH3 کارلێک لەگەڵ LH1αβ-14 دەکەن بۆ پێکهێنانی ڕوویەکی ترانزەمێمبرین (شێوەی 3، B و E تا G). ڕووکارەکە بە شێوەیەکی سەرەکی لە پاشماوەی Phe و Leu و Val لە ناوچەی ترانزەمێمبرین پێکهاتووە. ئەم پاشماوەیانە لەگەڵ ترشە ئەمینییە ئاو فۆبیکەکان و ڕەنگەکانی αβ-14 کۆدەکرێنەوە. هەروەها هەندێک لە پاشماوە جەمسەرییەکان بەشدارن لە کارلێکەکەدا، لەوانەش پەیوەندی هایدرۆجینی نێوان W-Thr68 و β-Trp42 لەسەر ڕووی بۆشایی ئاڵۆزەکە (شێوەی 3، F و G). لەسەر ڕووی سایتوبڵازما، Gln34 تەنیشت گروپی کیتۆی کارۆتینۆیدەکانی αβ-14 یە. سەرەڕای ئەوە، مۆلیکولی n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) چارەسەر بوو، و کلکی ئاو فۆبیکەکەی درێژ بووەوە بۆ ڕووکاری نێوان پڕۆتین-W و αβ-14، و ڕەنگە کلکی چەوری لە جەستەدا بێت. هەروەها تێبینیمان کرد کە ناوچەکانی وردبینی C-کۆتایی پڕۆتینی W و RCH زۆر نزیکن، بەڵام لە چوارچێوەی پێکهێنانی کارلێکی تایبەتدا نین (شێوەی 1، A و E). بەڵام لەوانەیە کارلێک لە ترشە ئەمینییە C-کۆتاییە چارەسەرنەکراوەکانی ئەم دوو پڕۆتینەدا هەبێت، کە ڕەنگە میکانیزمێک بۆ وەرگرتنی پڕۆتینی-W لە کاتی کۆکردنەوەی کۆمپلێکسی RC-LH114-W دابین بکات.
. (B) پڕۆتینی-W کە بە ڕوویەکی ڕەنگاوڕەنگی ئاو فۆبیک نیشان دەدرێت. ناوچە جەمسەرییەکان و بارگاوییەکان بە شێوەی سیان پیشان دراون، شوێنە ئاو فۆبیکەکان بە ڕەنگی سپی و ناوچە بەهێزەکانی ئاو فۆبیک بە ڕەنگی پرتەقاڵی پیشان دراون. (C و D) پرۆتینی-W کە لە کارتۆندا نیشان دراوە، ئاراستەکەی هەمان ئاراستەی (A) (C)ە، و بە 180° (D) دەسوڕێتەوە. بەپێی شوێنی ناو زنجیرەکە، پاشماوە جیاکراوەکان ڕەنگێکی کەوانەیی دەگرنەبەر، کە N-کۆتایی شینە و C-کۆتایی سوورە. (E) پڕۆتین-W لە هەمان دیمەنی (A)دا، و پاشماوەکان لە ڕووکاری پڕۆتین-W:LH1 بە داری بە نیشانە لکێنراوەکانەوە نیشان دەدرێن. (F) پڕۆتینی-W 90° بە بەراورد بە (E) و LH1αβ14 لە نوێنەرایەتی کارتۆنەکەدا دەسوڕێتەوە، و بە بەراورد بە پاشماوەی ڕووکار لە نوێنەرایەتی بارەکەدا. پاشماوەی هەڵواسراو لە پۆلیپێپتیدی بێتا ناوزەد کراون. کۆفاکتەرەکە وەکو بارێک نیشان دراوە کە لەگەڵ ڕەنگی وێنەی 1 دەگونجێت، β-DDM شیبووەوە بە ڕەنگی خۆڵەمێشی نیشان دراوە، و ئۆکسجین بە ڕەنگی سوور نیشان دراوە. (G) دیمەنەکە لە (F)دا بە 180° دەسوڕێتەوە، لەگەڵ پاشماوە دیارەکانی پۆلیپێپتیدی ئەلفا کە ناوی لێنراوە.
پڕۆتینی-W جێگەی هێتێرۆدایمەرێکی αβ دەگرێتەوە (15هەمین لە وێنەی 1F)، بەمەش ڕێگری لە داخستنی لوپ دەکات و سێ هێتێرۆدایمەری یەکەمی αβ دەشێوێنێت. تێبینی کرا کە زۆرترین گۆشەی مەیلی یەکەم αβ-1 هێتێرۆدایمەر بە بەراورد بە فیلمی ئاسایی 25° بۆ 29° بوو (شێوەی 1، A و E)، کە بەهۆی 2° بۆ 8° مەیلی αβ-1 لە RC A sharp contrast-LH116 دروست بوو (شێوەی 1، B و F). هێتێرۆدایمەری دووەم و سێیەم بە ڕێککەوت لە 12° بۆ 22° و 5° بۆ 10° مەیلیان هەیە. بەهۆی بەربەستی ستێریکی RC، مەیلبوونی αβ-1 جووتە دووەمی αβ لەخۆناگرێت (کە هاوتایە لەگەڵ αβی 16 لە وێنەی 1F)، بەم شێوەیە بۆشایییەکی ڕوون لە ئەڵقەی LH1 دروست دەکات (شێوەی 1، A و E). بەهۆی نەبوونی دوو هێتێرۆدایمەری αβ، لەگەڵ لەدەستدانی چوار BChl و دوو کارۆتینۆید، هیچ کام لە کارۆتینۆیدەکان بە ژێر یەکەی αβ-1ی پێچاوپێچەوە نابەسترێتەوە، لە ئەنجامدا ئەڵقەیەکی LH114-W دروست دەبێت کە 13 کارۆتینۆید ڕووەکی و 28 BChls لەخۆدەگرێت. خەمڵاندنی وردبینی ناوخۆیی دوو ئاڵۆزەکە لە ناوچەکانی αβ1 بۆ 7 کەمترە لە خەمڵاندنی باقی لوپی LH1، کە ڕەنگە ڕەنگدانەوەی پلاستیسیتی سروشتی ژێر یەکەی LH1ی تەنیشت شوێنی RC QB بێت (شێوەی 4).
وێنەکانی RC-LH114-W (A و B) و RC-LH116 (C و D) لە هەمان دیمەنی سەرەوە/دیمەنی لاوەکی (A و B) (A و C) و ڕووی بۆشایی وێنەی 1. (B و D) نیشان دراون. کلیلە ڕەنگاوڕەنگەکان لە لای ڕاستەوە نیشان دراون.
تاکە کۆمپلێکسی ناوەکی تایبەتمەندی تر کە ڕێژەی ستۆکیۆمێتری 1:14 یە، دایمەری ڕۆدۆکۆکۆس سفارۆیدس (Rba.) RC-LH1-PufX (13) یە. بەڵام پڕۆتینی W و PufX هیچ هاوشێوەیەکی دیاریان نییە، و کاریگەرییەکی بەرچاویان لەسەر پێکهاتەی LH1ی هەریەکەیان هەیە. PufX تاکە TMH یە کە دۆمەینی سایتوبڵازمای N-کۆتایی هەیە کە لەگەڵ لایەنی سایتوبڵازمای ژێر یەکەی RC-H (13) لە شوێنێکدا کە هاوتایە لەگەڵ Rps کارلێک دەکات. پالوستریس LH116αβ-16. PufX کەناڵێک بۆ ئاڵوگۆڕی کوینۆن/کوینۆلۆن لە نێوان RC-LH1 و کۆمپلێکسی سایتۆکرۆمی bcl دروست دەکات و لە هەموو Rbaەکاندا ئامادەیە. کۆمپلێکسی ناوەکی sphaeroides (13). هەرچەندە ڕووکاری مۆنۆمێر-مۆنۆمێر لە Rba دایە. دایمەری سفایرۆیدەکانی RC-LH1-PufX لە شوێنی بەستنەوەی پڕۆتینی W لە RC-LH114-W دایە، و بۆشایی کە بەهۆی PufX و پڕۆتینی-W هێنراوەتەوە لە شوێنێکی هاوتادایە (شێوەی S7A). هەروەها بۆشایی لە RC-LH114-W لەگەڵ کەناڵی کوینۆنی گریمانەیی (8)ی Pseudomonas rosea LH1 هاوتەریبە، کە لەلایەن پێپتیدەکانەوە دروست دەبێت کە پەیوەندییان بە پڕۆتینی W یان PufX نییە (شێوەی S7B). جگە لەوەش کەناڵی کوینۆن لە Blc. سەوزی زمردی LH1 کە بە دەرکردنی یەک ژێر یەکەیەکی γ (7) دروست بووە لە شوێنێکی هاوشێوەدا هەڵکەوتووە (شێوەی S7C). هەرچەندە لەلایەن پڕۆتینە جیاوازەکانەوە ناوبژیوان دەکرێت، بەڵام دەرکەوتنی ئەم کەناڵانەی کوینۆن/کوینۆلۆڵ لە شوێنێکی هاوبەشدا لە کۆمپلێکسی RC-LH1دا پێدەچێت نموونەی پەرەسەندنی یەکگرتوو بێت، ئەمەش ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە ئەو بۆشاییەی کە لەلایەن پڕۆتینی W دروستکراوە لەوانەیە وەک کەناڵێکی کوینۆن کاربکات.
بۆشایی لە لوپی LH114-W ڕێگە بە دروستبوونی ناوچەیەکی پەردەیی بەردەوام دەدات لە نێوان بۆشایی ناوەوەی کۆمپلێکسی RC-LH114-W و پەردەی گەورە (شێوەی 1G)، نەک دوو دۆمەینەکە لە ڕێگەی کونیلەیەکی پڕۆتین وەک لە پڕۆتینەکاندا بەیەکەوە ببەستێتەوە. کۆمپلێکسی RC-LH116 هاوشێوەی Tch داخراوە. کۆمپلێکسێکی هاوشێوەی دەرزی (22) (شێوەی 1H). بەو پێیەی بڵاوبوونەوەی کوینۆن لە ڕێگەی پەردەکەوە خێراترە لە بڵاوبوونەوەی لە ڕێگەی کەناڵی پڕۆتینی تەسکەوە، لوپی کراوەی LH114-W دەتوانێت ڕێگە بدات بە گۆڕینی خێراتری RC لە چاو لوپی LH116 داخراو، و بڵاوبوونەوەی کوینۆن بۆ ناو RC لەوانەیە سنووردارتر بێت. بۆ ئەوەی تاقی بکەینەوە کە ئایا پڕۆتینی W کاریگەری لەسەر گۆڕینی کوینۆنەکان هەیە لە ڕێگەی RC، ئێمە تاقیکردنەوەی ئۆکساندنی سایتۆکرۆممان ئەنجامدا لەسەر چڕییەکی دیاریکراوی یوبیکوینۆن 2 (UQ2) (ئەنالۆگێکی سروشتی UQ10 کە کلکی ئایزۆپرینێکی کورتترە) (شێوەی 2E). هەرچەندە بوونی کوینۆنی کیلێت ڕێگری دەکات لە دیاریکردنی وردی نەگۆڕی ڕواڵەتی مایکلیس (RC-LH114-W و RC-LH116 گونجاون بۆ 0.2±0.1μM و 0.5±0.2μM، بە ڕێککەوت)، بەڵام زۆرترین ڕێژەی RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) یە 28±5% گەورەترە لە RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
ئێمە سەرەتا خەمڵاندمان کە پڕۆتین-W لە نزیکەی 10%ی کۆمپلێکسی ناوەکیدا هەیە (16); لێرەدا، ڕێژەی داگیرکردنی خانەکانی گەشەکردنی ڕووناکی کەم، ڕووناکی مامناوەند و ڕووناکی بەرز 15±0.6%، 11±1% و 0.9±0.5، بە ڕێککەوت % (شێوەی 2F). بەراوردکردنی چەندایەتی سپێکترۆمێتری بارستەیی دەریخست کە زیادکردنی تاگی هیستیدین زۆری ڕێژەیی پڕۆتین-W کەم نەکردەوە بە بەراورد بە جۆرە کێوییەکان (P = 0.59)، بۆیە ئەم ئاستانە شتێکی دەستکردی پڕۆتینی-W دەستکاریکراو نین (شێوەی S10). بەڵام، ئەم داگیرکردنی کەمەی پڕۆتینی-W لە کۆمپلێکسی RC-LH1 ڕەنگە ڕێگە بدات هەندێک لە RCەکان بە ڕێژەیەکی خێراتر بگۆڕدرێن، بەمەش ئاڵوگۆڕی خاوتری کوینۆن/کوینۆلۆن لە کۆمپلێکسی RC-LH116 کەم دەکاتەوە. ئێمە تێبینیمان کرد کە ڕێژەی بەرزی داگیرکردنی ڕووناکی لەگەڵ داتاکانی ئەم دواییەی ترانسکریپتۆمیکسدا ناتەبایە، کە ئاماژەیە بۆ ئەوەی دەربڕینی جینی pufW لە ژێر ڕووناکی بەهێزدا زیاد دەکات (شێوەی S11) (23). جیاوازی نێوان نووسینەوەی pufW و یەکخستنی پڕۆتین-W بۆ ناو کۆمپلێکسی RC-LH1 سەرلێشێواو و ڕەنگە ڕەنگدانەوەی ڕێکخستنی ئاڵۆزی پڕۆتینەکە بێت.
لە RC-LH114-W، 6 کاردیۆلیپین (CDL)، 7 فۆسفاتیدیلکۆلین (POPC)، 1 فۆسفاتیدیل گلیسیرۆل (POPG) و 29 مۆلیکولی β-DDM تەرخانکراون و مۆدێلکراون تێیدا 6 CDL، 24 POPC، 2 POPG و 12 βDDM. RC-LH116 (شێوەی 5، A و B). لەم دوو پێکهاتەدا، CDL نزیکە لە لایەنی سایتوبڵازمای کۆمپلێکسەکەدا جێگیر بێت، لە کاتێکدا POPC، POPG و β-DDM زیاتر لە لایەنی لومیناڵدا هەڵکەوتوون. دوو مۆلیکولی چەوری و پاککەرەوە لە ناوچەی αβ-1 بۆ αβ-6 لە کۆمپلێکسی RC-LH114-W جیاکرانەوە (شێوەی 5A)، و پێنج لە ناوچەی هاوتای RC-LH116 جیاکرانەوە (شێوەی 5B). چەوری زیاتر لە دیوەکەی تری کۆمپلێکسەکەدا دۆزرایەوە، بە شێوەیەکی سەرەکی CDL، کە لە نێوان RC و αβ-7 تا αβ-13 کۆبوونەتەوە (شێوەی 5، A و B). چەوری و پاککەرەوەکانی تری پێکهاتەیی چارەسەرکراو لە دەرەوەی ئەڵقەی LH1 هەڵکەوتوون، و زنجیرە ئەسیلییە باش یەکلاکراوەکان لە نێوان ژێر یەکەکانی LH1 درێژدەبنەوە، بە شێوەیەکی تاقیکاری وەک β-DDM لە RC-LH114-Wدا دەستنیشانکراون، و وەک β-DDM لە RC تێکەڵەیەکی β-DDM و POPC-LH116 پێناسەکراون. شوێنی هاوشێوەی چەورییە کیلێتییەکان و پاککەرەوەکان لە پێکهاتەکەماندا ئاماژە بەوە دەکەن کە ئەوان شوێنی بەستنەوەی پەیوەندیدارن لە ڕووی فیزیۆلۆژییەوە (شێوەی S12A). هەروەها شوێنی مۆلیکولە هاوتاکان لە Tch دا یەکدەنگییەکی باشیان هەیە. نەرم و نیان و ترڤ. جۆری 970 RC-LH1s (شێوەی S12، B تا E) (9، 12) و پاشماوەی بەستنەوەی هایدرۆجینی گروپی سەری چەوری پاراستنی تاڕادەیەک باشیان لە ڕێکخستنی زنجیرەکەدا نیشان دا (شێوەی S13)، ئەمەش ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە CDL پارێزراو کە بەستراوەتەوە بە RC (24)، ئەم شوێنانە لەوانەیە لە کۆمپلێکسی RC-LH1دا پارێزراو بن.
(A و B) پێپتیدەکانی RC-LH114-W (A) و RC-LH116 (B) بە کارتۆنەکان نیشان دراون، و ڕەنگەکان بە داری نیشان دراون، بە بەکارهێنانی ڕەنگەکانی وێنەی 1. چەوریەکان بە سوور نیشان دراون، و پاککەرەوەکان بە ڕەنگی خۆڵەمێشی نیشان دراون. UQ بەستراو بە شوێنەکانی RC QA و QB زەردە، لە کاتێکدا UQ دابڕاو شینە. (C و D) هەمان بۆچوونەکانی (A) و (B)، لەگەڵ چەورییەکان لابراون. (E بۆ G) دیمەنی گەورەکراوی Q1(E)، Q2(F) و Q3(G) لە RC-LH116، لەگەڵ زنجیرە لاوەکییەکان کە کاریگەرییان لەسەر یەکتر هەیە. پەیوەندییە هایدرۆجینییەکان وەک هێڵی ڕەشی خاڵی نیشان دراون.
لە RC-LH116 دا، هەردوو RC QA و QB UQ کە بەشدارن لە گواستنەوەی ئەلکترۆنەکان لە پرۆسەی جیاکردنەوەی بارگەدا، لە شوێنی بەستنەوەیاندا شی دەبنەوە. بەڵام لە RC-LH114-W دا QB quinone چارەسەر نەکراوە و لە خوارەوە بە وردی باس دەکرێت. جگە لە کوینۆنەکانی QA و QB، دوو مۆلیکولی UQ ی کیلێتکراو (کە لە نێوان ئەڵقەکانی RC و LH1 هەڵکەوتوون) لە پێکهاتەی RC-LH114-W بەپێی گروپە سەرە باش چارەسەرکراوەکانیان تەرخانکراون (کە بە ڕێککەوت لە Q1 و Q2 جێگیرکراون). مەودا). وێنەی 5C). دوو یەکەی ئایزۆپرین بۆ Q1 دیاری کراون، و نەخشەی چڕی 10 کلکی تەواوەتی ئایزۆپرینی Q2 چارەسەر دەکات. لە پێکهاتەی RC-LH116دا، سێ مۆلیکولی UQ10ی کیلێتکراو (Q1 بۆ Q3، وێنەی 5D) یەکلاکرانەوە، و هەموو مۆلیکولەکان چڕییەکی ڕوونیان هەیە بە درێژایی کلک (شێوەی 5، D تا G). لە دوو پێکهاتەکەدا، شوێنی گروپەکانی سەری کوینۆنی Q1 و Q2 یەکدەنگییەکی نایابیان هەیە (شێوەی S12F)، و تەنها کارلێک لەگەڵ RC دەکەن. Q1 لە دەروازەی بۆشایی W ی RC-LH114-W دایە (شێوەی 1G و 5، C، D و E)، و Q2 لە نزیک شوێنی بەستنەوەی QB دایە (شێوەی 5، C، D) و F). پاشماوەی پارێزراوی L-Trp143 و L-Trp269 زۆر نزیکە لە Q1 و Q2 و کارلێکی π-کۆکردنەوەی پۆتانسێل دابین دەکەن (شێوەی 5، E و F، و وێنەی S12). L-Gln88، 3.0 Å لە ئۆکسجینی دووری Q1، پەیوەندییەکی هایدرۆجینی بەهێز دابین دەکات (شێوەی 5E); ئەم پاشماوەیە لە هەموو RCەکاندا پارێزراوە جگە لە دوورترین پەیوەندی (شێوەی S13). L-Ser91 بە شێوەیەکی کۆنەپەرستانە جێگرەوەی Thr یە لە زۆربەی RCەکانی تردا (شێوەی S13)، 3.8 ئەنگسترۆمە لە ئۆکسجینی میتیل Q1، و لەوانەیە پەیوەندی هایدرۆجینی لاواز دابین بکات (شێوەی 5E). پێناچێت Q3 کارلێکی تایبەتی هەبێت، بەڵام لە ناوچەی ئاو فۆبیک لە نێوان ژێر یەکەی RC-M و ​​ژێر یەکەی LH1-α 5 تا 6 هەڵکەوتووە (شێوەی 5، D و G). هەروەها Q1، Q2 و Q3 یان کوینۆنە کیلێتەکانی نزیک لە Tch. نەرم و نیان، ترڤ. پەستانی 970 و Blc. پێکهاتەی ئیریس (9، 10، 12) ئاماژە بە شوێنی بەستنەوەی کوینۆنی یارمەتیدەری پارێزراو دەکات لە کۆمپلێکسی RC-LH1 (شێوەی S12G). پێنج UQ شیبووەوە لە RC-LH116 لەگەڵ 5.8±0.7ی هەر کۆمپلێکسێک کە بە کرۆماتۆگرافی شلەی کارایی بەرز (HPLC) دیاری کراوە، لە کاتێکدا سێ UQ شیبووەوە لە RC-LH114-W کەمترە لە بەهای پێوراو 6.2±0.3 (شێوەی S14) ئاماژەیە بۆ ئەوەی کە مۆلیکولی UQ چارەسەرنەکراو لە پێکهاتەکەدا هەیە.
پۆلیپێپتیدەکانی L و M ساختە هاوسەنگ هەریەکەیان پێنج TMH لەخۆدەگرن و هێتێرۆدایمەرێک پێکدەهێنن کە یەک دایمەری BChl، دوو مۆنۆمێری BChl، دوو مۆنۆمێری بەکتریافاژ (BPh) و یەک ئاسنی نا-هیم و یەک یان دوو مۆلیکولی UQ10 تێکەڵ دەکات. لە ڕێگەی بوونی پەیوەندی هایدرۆجین لەسەر گروپی کیتۆنی کۆتایی و کەڵەکەبوونی ناسراوی لە Rps، کارۆتینۆیدەکان لە ژێر یەکەی Mدا جێگیر دەکرێن، کە ناوی cis-3,4-dehydroorhodopin ە. جۆرەکان (٢٥). دۆمەینی دەرەوەی پەردەی RC-H بە یەک TMH بە پەردەکەوە بەستراوەتەوە. پێکهاتەی گشتی RC هاوشێوەی سێ ژێر یەکەی RC ی جۆرە پەیوەندیدارەکانە (وەک Rba). سپایرۆیدەکان (PDB ID: 3I4D). ماکرۆسایکڵەکانی BChl و BPh، بڕبڕەی پشتی کارۆتینۆید و ئاسنی نا-هیم لە مەودای ڕوونی ئەم پێکهاتانەدا سەریەک دەخەن، هەروەها گروپی سەری UQ10 لە شوێنی QA و کوینۆنی QB لە RC-LH116 (شێوەی S15).
بەردەستبوونی دوو پێکهاتەی RC بە ڕێژەی جیاوازی داگیرکردنی شوێنی QB دەرفەتێکی نوێ بۆ پشکنینی گۆڕانکارییە کۆنفۆڕماسیۆنییە بەردەوامەکان کە هاوڕێی بەستنەوەی کوینۆنی QBن دەڕەخسێنێت. لە کۆمپلێکسی RC-LH116، کوینۆنی QB لە شوێنی "نزیک"ی تەواو بەستراودایە (26)، بەڵام جیاکردنەوەی RC-LH114-W کوینۆنی QBی نییە. لە RC-LH114-W هیچ کوینۆنی QB نییە، ئەمەش شتێکی سەرسوڕهێنەرە چونکە کۆمپلێکسەکە چالاکە، زیاتر لە کۆمپلێکسی RC-LH116 کە کوینۆنی QB کە لە ڕووی پێکهاتەییەوە چارەسەر کراوە. هەرچەندە دوو ئەڵقەی LH1 نزیکەی شەش کوینۆن کیل دەکەن، بەڵام پێنجیان لە ڕووی پێکهاتەییەوە لە ئەڵقەی داخراوی RC-LH116دا یەکلایی دەکرێنەوە، لە کاتێکدا تەنها سێ ئەڵقەی پێکهاتەیی سنووردارن لە ئەڵقەی کراوەی RC-LH114-W. ئەم زیادبوونی تێکچوونی پێکهاتەیی ڕەنگە ڕەنگدانەوەی گۆڕینی خێراتری شوێنەکانی RC-LH114-W QB، جووڵەی خێراتری کوینۆن لە کۆمپلێکسەکەدا، و زیادبوونی ئەگەری بەزاندنی لوپی LH1 بێت. ئێمە پێشنیار دەکەین کە نەبوونی UQ لە شوێنی RC QB ی RC-LH114-W لەوانەیە لە ئەنجامی کۆمپلێکسێکی ئاڵۆزتر و چالاکتر بێت، و شوێنی QB ی RC-LH114-W دەستبەجێ بەستراوەتەوە لە گۆڕینی UQ قۆناغی تایبەت (دەرگای چوونە ژوورەوە بۆ شوێنی QB داخراوە) ڕەنگدانەوەی کۆنفۆڕماسیۆنی ئەم چالاکییە دەبێت.
بەبێ QB، خولانەوەی هاوڕێی L-Phe217 بۆ شوێنێک کە لەگەڵ بەستنەوەی UQ10 ناگونجێت، چونکە دەبێتە هۆی پێکدادانی فەزایی لەگەڵ یەکەم یەکەی ئایزۆپرینی کلک (شێوەی 6A). سەرەڕای ئەوە، گۆڕانکارییە سەرەکییە کۆنفۆڕماسیۆنییە دیارەکان دیارن، بە تایبەت هێلیکس دی (هێلیکسی کورت لە لوپی نێوان TMH D و E) کە L-Phe217 دەگوازرێتەوە بۆ گیرفانی بەستنەوەی QB و خولانەوەی L-Tyr223 (شێوەی 6A) بۆ شکاندنی پەیوەندی هایدرۆجین لەگەڵ چوارچێوەی M-Asp45 و داخستنی دەرگای شوێنی بەستنەوەی QB (شێوەی ٦B). هێلیکس لە بنکەکەیدا دەسوڕێتەوە، Cα ی L-Ser209 بە 0.33Å دەگۆڕێت، لە کاتێکدا L-Val221Cα بە 3.52Å دەگۆڕێت. هیچ گۆڕانکارییەکی چاودێرکراو لە TMH D و Eدا نییە، کە لە هەردوو پێکهاتەکەدا دەتوانرێت لەسەر یەک دابنرێت (شێوەی 6A). ئەوەندەی ئێمە دەزانین ئەمە یەکەم پێکهاتەیە لە RC سروشتیدا کە شوێنی QB دادەخات. بەراوردکردن لەگەڵ پێکهاتەی تەواو (QB-bound) نیشان دەدات کە پێش ئەوەی کوینۆنەکە کەم بێتەوە، گۆڕانکارییەکی کۆنفۆڕماسیۆنی پێویستە بۆ ئەوەی بچێتە ناو کوینۆنەکەوە. L-Phe217 دەسوڕێتەوە بۆ پێکهێنانی کارلێکێکی π-stacking لەگەڵ گروپی سەری کوینۆن، و هێلیکسەکە دەگۆڕێت بۆ دەرەوە، ڕێگە بە ئێسکەپەیکەری L-Gly222 و زنجیرە لاوەکییەکەی L-Tyr223 دەدات تۆڕێکی پەیوەندی هایدرۆجینی پێکبهێنن کە پێکهاتەیەکی پەیوەندی هایدرۆجینی جێگیرە (شێوەی 6، A و C).
(A) کارتۆنی سەریەککەوتووی هۆلۆگرام (زنجیرەی L، زنجیرەی پرتەقاڵی/M، مەجنتا) و پێکهاتەی ئەپۆ (خۆڵەمێشی)، کە تێیدا پاشماوە سەرەکییەکان لە شێوەی نوێنەرایەتییەکی هاوشێوەی داریدا پیشان دەدرێن. UQ10 بە هێڵێکی زەرد نیشان دەدرێت. هێڵی خاڵبەندی ئاماژەیە بۆ ئەو پەیوەندییە هایدرۆجینانەی کە لە تەواوی پێکهاتەکەدا دروست بوون. (B و C) نوێنەرایەتی ڕووکاری ئەپۆلیپۆپڕۆتین و تەواوی پێکهاتەی ئەڵقە، کە تیشک دەخاتە سەر ئۆکسجینی زنجیرە لاوەکییەکەی L-Phe217 بە ڕەنگی شین و L-Tyr223 بە ڕەنگی سوور، بە ڕێککەوت. ژێر یەکەی L پرتەقاڵییە؛ ژێر یەکەکانی M و H ڕەنگاوڕەنگ نین. (D و E) شوێنەکانی ئەپۆلیپۆپڕۆتینی (D) و تەواوی (E) RC QB [ڕەنگ بەپێی (A) بە ڕێککەوت] و Thermophilus thermophilus PSII (سەوز، شین لەگەڵ کوینۆنی پلاستیکی؛ PDB ID: 3WU2) ڕێکبخە (58).
بە شێوەیەکی چاوەڕواننەکراو، هەرچەندە چەندین پێکهاتەی RCی کەمی QB بەبێ LH1 بەردەستە، بەڵام گۆڕانکارییە کۆنفۆڕماسیۆنییەکان کە لەم لێکۆڵینەوەیەدا بینراون پێشتر ڕاپۆرت نەکراون. لەوانە پێکهاتەی کەمبوونەوەی QB لە Blc. viridis (ناسنامەی PDF: 3PRC) (27)، Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) و Rba. سپایرۆیدەکان (PDB ID: 1OGV) (29)، کە هەموویان نزیکەی هەمان پێکهاتەی QB گشتیی خۆیانن. پشکنینی وردی 3PRC دەریخست کە مۆلیکولەکانی پاککەرەوەی LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) لە دەروازەی شوێنی QB دەبەسترێتەوە، کە لەوانەیە ڕێگری بکات لە ڕێکخستنەوەی دووبارە بۆ کۆنفۆڕماسیۆنێکی داخراو. هەرچەندە LDAO لە هەمان شوێن لە 1EYS یان 1OGVدا شی نابێتەوە، بەڵام ئەم RCانە بە بەکارهێنانی هەمان پاککەرەوە ئامادە دەکرێن و هەربۆیە لەوانەیە هەمان کاریگەری بەرهەم بهێنن. پێکهاتەی بلوری Rba. هەروەها پێدەچێت Sphaeroides RC هاوکریستاڵ لەگەڵ سایتۆکرۆمی c2 (PDB ID: 1L9B) شوێنی QB داخراویان هەبێت. بەڵام لەم حاڵەتەدا، ناوچەی N-کۆتایی پۆلیپێپتیدی RC-M (کارلێککردن لەگەڵ شوێنی بەستنەوەی QB لە ڕێگەی پەیوەندی H ی پاشماوەی Tyr لەسەر هێلیکسی Q) کۆنفۆڕماسیۆنێکی ناسروشتی دەگرێتەبەر، و گۆڕانکاری کۆنفۆڕماسیۆنی QB زیاتر لێکۆڵینەوەی لەسەر ناکرێت (30). ئەوەی دڵنیاکەرەوەیە ئەوەیە کە ئێمە ئەم جۆرە شێواندنەی پۆلیپێپتیدی Mمان لە پێکهاتەی RC-LH114-W نەبینیوە، کە نزیکەی هەمان ناوچەی N-کۆتایی RC-LH116 RC ە. هەروەها پێویستە ئاماژە بەوە بکرێت کە دوای بنبڕکردنی ئەنتێنەی LH1 لەسەر بنەمای پاککەرەوە، RC ی ئەپۆلیپۆپڕۆتینی لە PDB چارەسەر کران، کە حەوزەکانی ناوەوەی کوینۆن و چەورییەکانی لە بۆشایی نێوان RC و ڕووی ناوەوەی ئەڵقەی LH1ی دەوروبەریدا نەهێشت (31، 32). RC بە کارایی دەمێنێتەوە چونکە هەموو هاوفاکتەرەکان دەهێڵێتەوە، جگە لە کوینۆنی QB شیبووەوە کە کەمتر جێگیرە و زۆرجار لە کاتی پرۆسەی ئامادەکردندا لەدەست دەچێت (33). سەرەڕای ئەوە، دەزانرێت کە لابردنی LH1 و چەورییە خولییە سروشتییەکان لە RC دەتوانێت کاریگەری لەسەر ئەرکەکان هەبێت، وەک کورتبوونەوەی تەمەنی دۆخی P+QB کە بە بارگە جیاکراوەتەوە (31، 34، 35). بۆیە ئێمە پێشبینی دەکەین کە بوونی ئەڵقەی LH1ی ناوخۆیی کە دەوروبەری RC ڕەنگە شوێنی QB "داخراو" بپارێزێت، بەمەش ژینگەی ناوخۆیی لە نزیک QB دەپارێزێت.
هەرچەندە ئەپۆلیپۆپڕۆتین (بەبێ QB quinone) و پێکهاتەی تەواو تەنها دوو وێنەی خێرا لە گۆڕینی شوێنی QB نوێنەرایەتی دەکەن، نەک زنجیرەیەک ڕووداو، ئاماژە هەیە کە دەتوانرێت بەستنەوەکە دەروازە بکرێت بۆ ڕێگریکردن لە دووبارە بەستنەوە لەلایەن هایدرۆکوینۆن بۆ ڕێگریکردن لە ڕێگریکردنی ژێرخان. کارلێکی کوینۆلۆڵ و کوینۆن لە نزیک شوێنی QB ی ئەپۆلیپۆپڕۆتین لەوانەیە جیاواز بێت، کە دەبێتە هۆی ڕەتکردنەوەی لەلایەن RC. لە مێژە پێشنیار کراوە کە گۆڕانکارییەکانی کۆنفۆڕماسیۆن ڕۆڵ دەگێڕن لە بەستنەوە و کەمکردنەوەی کوینۆنەکان. توانای RC بەستووەکان بۆ کەمکردنەوەی کوینۆنەکان دوای گونجانی تاریکی تێکدەچێت (36); کریستاڵۆگرافی تیشکی ئێکس نیشان دەدات کە ئەم زیانە بەهۆی گیرخواردنی کوینۆنەکانی QB لە کۆنفۆڕماسیۆنێکی "دوور"دا نزیکەی 4.5 Å لە شوێنی چالاکانەی نزیکەوەیە (26) , 37). ئێمە پێشنیار دەکەین کە ئەم کۆنفۆڕماسیۆنی بەستنەوەی دوور وێنەیەکی خێرا لە دۆخی نێوان ئەپۆلیپۆپڕۆتین و پێکهاتەی ئەڵقەی تەواو، کە دوای کارلێکی سەرەتایی لەگەڵ کوینۆن و کردنەوەی شوێنی QB دێت.
جۆری II RC کە لە کۆمپلێکسی PSII ی هەندێک بەکتریا فۆتۆتڕۆفیک و بەکتریا سیانییەکان، چڵکن و ڕووەکەکاندا دۆزراوەتەوە، پاراستنی پێکهاتەیی و کارایی هەیە (38). ڕێکخستنی پێکهاتەیی کە لە وێنەی 6 (D و E) دا نیشان دراوە جەخت لەسەر لێکچوونی نێوان PSII RCs و شوێنی QB ی کۆمپلێکسی RC بەکتریا دەکاتەوە. ئەم بەراوردکردنە لە مێژە مۆدێلێکە بۆ لێکۆڵینەوە لە سیستەمە نزیکەکانی پەیوەست بە بەستنەوە و کەمکردنەوەی کوینۆن. بڵاوکراوەکانی پێشوو پێشنیاریان کردووە کە گۆڕانکارییەکانی کۆنفۆڕماسیۆن لەگەڵ کەمبوونەوەی PSIIی کوینۆنەکاندایە (39، 40). بۆیە، بە لەبەرچاوگرتنی پاراستنی پەرەسەندنی RC، ئەم میکانیزمەی بەستنەوەی پێشتر چاودێری نەکراوە ڕەنگە بۆ شوێنی QB ی PSII RC لە ڕووەکە فۆتۆتڕۆفیکە ئۆکسجیندارەکاندا بەکاربهێنرێت.
جۆرەکانی Rps ΔpufW (سڕینەوەی pufW بێ نیشانە) و PufW-His (C-کۆتایی 10x His-tagged protein-W کە لە شوێنی سروشتی pufW دەربڕدراوە). palustris CGA009 لە کارەکانی پێشووماندا باسکراوە (16). ئەم جۆرانە و دایک و باوکی جۆری کێوی ئایزۆجینیک لە بەفرگرەکە وەرگیرانەوە بە ڕیزکردنی ژمارەیەکی کەم لە خانەکان لەسەر PYE (هەر 5 گم لیتر -1) (لە LB لە پلەی گەرمی -80 °C هەڵگیرا، کە 50% (ک/ح) پڕۆتینی گلیسیرۆلی تێدایە، دەرهاویشتەی مەعجوون و سوکسینات) ئاگار [1.5% (ک/v)] پلێت. پلێتەکە بۆ ماوەی شەوێک لە تاریکیدا لە پلەی گەرمی ژووردا لە ژێر بارودۆخی بێهەوادا کەرەوز کرا، و پاشان بە ڕووناکی سپی (~50 μmolm-2 s-1) کە لەلایەن گڵۆپی هالۆجینی OSRAM 116-W (RS Components, UK) دابینکرابوو بۆ ماوەی 3 بۆ 5 ڕۆژ ڕووناککرایەوە تاوەکو یەک کۆڵۆنی دەرکەوت. تاکە کۆڵۆنییەک بەکارهێنرا بۆ کوتانی 10 مل لە ناوەندی M22+ (41) کە تەواوکەری 0.1% (ک/حە) ترشە کازامینیەکان (لەمەودوا بە M22 ناودەبرێت). کشتوکاڵەکە لە ژێر بارودۆخی کەمی ئۆکسجین لە تاریکیدا لە پلەی گەرمی 34 پلەی سەدی لەگەڵ لەرزین بە خێرایی 180 خولەک لە خولەکێکدا بۆ ماوەی 48 کاتژمێر گەشەپێدرا، و پاشان 70 مل لە کشتوکاڵەکە لە ژێر هەمان بارودۆخدا بۆ ماوەی 24 کاتژمێر کوتێنرا. کشتوکاڵی نیمچە هەوای بە قەبارەی 1 مل بەکاردێت بۆ کوتانی 30 مل لە ناوەندی M22 لە شووشەیەکی شەفافی 30 مل و گشتگیر بە سەری پیچ و بە تێکەڵکردن (~50μmolm-2 s-1) بۆ ماوەی 48 کاتژمێر بە هێزی موگناتیسی تەعقیمکراو داری تێکەڵکردن تیشک دەدرێت. پاشان 30 مل لە کشتوکاڵەکە بە نزیکەی 1 لیتر کشتوکاڵەکە لە هەمان بارودۆخدا کوتێنرا، کە دواتر بەکارهێنرا بۆ کوتانی نزیکەی 9 لیتر کشتوکاڵەکە کە لە ~200 μmolm-2 s-1 بۆ ماوەی 72 کاتژمێر ڕووناککرابووەوە. خانەکان بە سەنتەرفۆجکردن لە 7132 RCF بۆ ماوەی 30 خولەک کۆکرانەوە، لە ~10 مل لە 20 میلی مۆلی تریس-HCl (pH 8.0) هەڵواسرانەوە، و لە پلەی گەرمی -20 پلەی سەدی هەڵگیران تا پێویست بوو.
دوای توانەوەی، هەندێک کریستاڵ لە دیۆکسی ڕیبۆنۆکلیاز I (Merck, UK)، لایسوزایم (Merck، UK) و دوو حەبی ڕێگریکەری هۆلۆئەنزیم پرۆتئازی ڕۆش (Merck, UK) زیاد بکە بۆ خانە هەڵواسراوەکان. لە خانەیەکی پەستانی فەرەنسی ٢٠ هەزار psi (ئەمینکۆ، ئەمریکا)، خانەکان ٨ بۆ ١٢ جار تێکچوون. پاش لابردنی خانە نەشکاوەکان و پاشماوەی نەتواوە بە سەنتەرفۆجکردن لە 18,500 RCF بۆ ماوەی 15 خولەک لە پلەی گەرمی 4 پلەی سەدی، پەردەکە لە لایزەتی ڕەنگاوڕەنگ بە سەنتەرفۆجکردن لە 113,000 RCF بۆ ماوەی 2 کاتژمێر لە پلەی گەرمی 43,000 پلەی سەدی ڕەشکرا. بەشە تواوەکە فڕێ بدە و پەردەی ڕەنگاوڕەنگ لە 100 بۆ 200 مل لە 20 میلی مۆلی تریس-HCl (pH 8.0) هەڵواسەوە و یەکسان بکە تاوەکو هیچ کۆکراوەیەکی دیار نامێنێت. پەردەی هەڵواسراو لە 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) کە 2% (w/v) β-DDM ی تێدابوو بۆ ماوەی 1 کاتژمێر لە تاریکیدا لە پلەی گەرمی 4°C بە تێکەڵکردنی نەرم کەرەوز کرا. پاشان لە پلەی گەرمی 70 پلەی سەدیدا سەنتەرفۆج بکە بۆ ئەوەی 150,000 RCF لە پلەی گەرمی 4 پلەی سەدی بۆ ماوەی 1 کاتژمێر بتوێنەوە بۆ لابردنی پاشماوەی نەتواوە.
پەردەی تواوەکەرەوە لە جۆری ΔpufW بەکارهێنرا بۆ ستوونی ئاڵوگۆڕی ئایۆنی DEAE سیفارۆزی 50 مل لەگەڵ سێ قەبارەی ستوونی (CV)ی بافەری بەستنەوە [20 میلی مۆلی tris-HCl (pH 8.0) کە 0.03% (ک / v) β-DDMی تێدایە]. ستوونەکە بە دوو بافەری بەستنەوەی CV بشۆ، و پاشان ستوونەکە بە دوو بافەری بەستنەوە بشۆ کە 50 میلی مۆلی NaCl یان تێدایە. کۆمپلێکسی RC-LH116 بە گرادێنتێکی هێڵی 150 بۆ 300 میلی مۆلی NaCl (لە ناو بافەری بەستنەوە) لەسەر 1.75 CV شۆردراوە، و کۆمپلێکسی بەستنەوەی ماوەتەوە بە بافەرێکی بەستنەوە کە 300 میلی مۆلی NaClی تێدابوو لەسەر 0.5 CV شۆردراوە. سپێکتریمی مژینی لە نێوان 250 و 1000 نانۆمەتر کۆبکەرەوە، بەشەکە بە ڕێژەی مژینی (A880/A280) زیاتر لە 1 لە 880 بۆ 280 نانۆمەتردا بهێڵەرەوە، دوو جار لە بافەری بەستنەوەدا شل بکەرەوە، و هەمان ڕێکار دووبارە بەکاربهێنە لەسەر ستوونی DEAE لە کاتی پاککردنەوەدا. ئەو بەشانەی کە ڕێژەی A880/A280 بەرزترە لە 1.7 و ڕێژەی A880/A805 زیاترە لە 3.0 شل بکەرەوە، خولی سێیەمی ئاڵوگۆڕی ئایۆن ئەنجام بدە، و بەشەکان بە ڕێژەی A880/A280 زیاتر لە 2.2 و ڕێژەی A880/A805 زیاتر لە 5.0 بهێڵەرەوە. کۆمپلێکسە بەشە پاککراوەکە بۆ ~2 مل لە فلتەری سەنتەرفۆجی بڕینی کێشی گەردیلەیی ئەمیکۆن 100,000 (MWCO) (Merck, UK) چڕکرایەوە، و لەسەر ستوونی دەرکردنی قەبارەی Superdex 200 16/600 (GE Healthcare، US) بارکرا کە 200 میلی مۆلی NaCl بافەری تێدابوو، و پاشان لە هەمان بافەردا لە 1.5 CV شۆردرا. سپێکتری مژینی بەشە دەرهێنانی قەبارە کۆبکەرەوە، و سپێکتری مژینی بە ڕێژەی A880/A280 لەسەر 2.4 و ڕێژەی A880/A805 لەسەر 5.8 بۆ 100 A880 چڕ بکەرەوە، و دەستبەجێ بەکاریان بهێنە بۆ ئامادەکردن یان هەڵگرتنی تۆڕی cryo-TEM بەکاریان بهێنە لە پلەی گەرمی -80°C تا پێویست.
پەردەی تواوە لە جۆری PufW-His بەکارهێنرا بۆ 20 مل ستوونی HisPrep FF Ni-NTA Sepharose (20 میلی مۆلی tris-HCl (pH 8.0) کە 200 میلی مۆلی NaCl و 0.03% (ک/ک)ی تێدایە) لە بافەری IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. ستوونەکە بە پێنج CV لە IMAC buffer شۆردرا، و پاشان بە پێنج CV ی IMAC buffer کە 10 mM هیستیدینی تێدابوو. کۆمپلێکسی ناوەکی لە ستوونەکە بە پێنج بافەری IMAC کە 100 میلی مۆلی هیستیدینیان تێدابوو شۆردرا. ئەو بەشەی کە کۆمپلێکسی RC-LH114-W ی تێدایە بۆ ~10 مل لە تانکییەکی تێکەڵکراودا چڕ دەکرێتەوە کە بە فلتەری Amicon 100,000 MWCO (Merck, UK) تەیار کراوە، 20 جار بە بافەری بەستنەوە شل دەکرێتەوە، و پاشان زیاد دەکرێت بۆ 25 مل لە ستوونی DEAE Sepharose، چوار CV بەستراو بە بافەرەکە پێشوەختە بەکاردەهێنرێت. ستوونەکە بە چوار بافەری بەستنەوەی CV بشۆ، پاشان کۆمپلێکسەکە لەسەر هەشت CV لەسەر گرادێنتێکی هێڵی 0 بۆ 100 mM NaCl (لە بافەری بەستنەوەدا) بشۆ، و چوار CVی دیکە کە 100 mM بافەری بەستنەوەی تێدایە کۆمپلێکسەکانی پاشماوە کە لەسەر کلۆریدی سۆدیۆم شۆردراون لەگەڵ ڕێژەی A880/A280 کە بەرزترە لە 2.4 و... ڕێژەی A880/A805 زیاتر لە 4.6 بەش چڕکرانەوە بۆ ~2 مل لە فلتەری سەنتەرفۆجی ئەمیکۆن 100,000 مێگاواتۆکەوە، و پڕکرایەوە لە 1.5 CV IMAC پێشوەختە بە بافەر هاوسەنگکراوی سوپەردێکس 200 16/600 قەبارەی ستوونی دەرکردن، و پاشان لە هەمان بافەردا لە سەرووی 1.5 سی ڤۆڵتدا شۆردرایەوە. سپێکتری مژینی بەشەکانی قەبارە-دەرکردن کۆبکەرەوە و سپێکتری مژینی بە ڕێژەی A880/A280 لەسەر 2.1 و A880/A805 لەسەر 4.6 بۆ 100 A880 چڕ بکەرەوە، کە دەستبەجێ بۆ ئامادەکردنی تۆڕی TEM بەستوو بەکاردەهێنرێن یان لە -80 پلەی سەدیدا هەڵدەگیرێن تا پێویستی.
بەفرگرێکی نوقمکردنی لایکا ئی ئێم جی پی بەکارهات بۆ ئامادەکردنی تۆڕەکانی TEM پلەی گەرمی نزم. کۆمپلێکسەکە لە IMAC بافەردا شلکرایەوە بۆ A880 ی 50، و پاشان 5μl بارکرا لەسەر تۆڕێکی مسی QUANTIFOIL 1.2/1.3 کە بە کاربۆنی پۆشراو بە درەوشاوەیی تازە دەرچوو (Agar Scientific, UK). تۆڕەکە لە پلەی گەرمی ٢٠ پلەی سەدی و شێداری ڕێژەیی ٦٠٪ بۆ ماوەی ٣٠ چرکە کەرەوز بکە، پاشان بۆ ماوەی ٣ چرکە وشکی بکەرەوە، و پاشان لەناو ئیتانی شلدا لە پلەی گەرمی -١٧٦ پلەی سەدیدا بیکوژێنەرەوە.
داتاکانی کۆمپلێکسی RC-LH114-W لەسەر eBIC (سەنتەری وێنەگرتنی زیندەیی ئەلیکترۆنی) (سەرچاوەی ڕووناکی ئەڵماسی بەریتانی) بە مایکرۆسکۆپی تایتانی کرۆس تۆمارکرا، کە بە ڤۆڵتیەی خێراکەری 300kV کاردەکات، لەگەڵ گەورەکردنی ناوەکی 130,000× و وزەی- بۆشایی 20 eV هەڵبژێرە. کوانتەمێکی Gatan 968 GIF لەگەڵ دۆزەرەوەی لوتکەی K2 بەکارهات بۆ تۆمارکردنی وێنەکان لە دۆخی ژماردن بۆ کۆکردنەوەی زانیاری. قەبارەی پێکسڵی قەبارەکراو 1.048Å یە، و ڕێژەی ژەمە دەرمانەکە 3.83 e-Å-2s-1 یە. فیلمەکەی لە ماوەی ١١ چرکەدا کۆکردەوە و دابەشی کرد بەسەر ٤٠ بەشدا. ئەو شوێنەی کە کاربۆنی پۆشراوە بەکاربهێنە بۆ دووبارە فۆکەسکردنی مایکرۆسکۆپەکە، و پاشان سێ فیلم لە هەر کونێکدا کۆبکەرەوە. بە گشتی 3130 فیلم کۆکرانەوە، بەهاکانی دیفۆکۆس لە نێوان -1 و -3μm.
داتاکانی کۆمپلێکسی RC-LH116 بە بەکارهێنانی هەمان مایکرۆسکۆپ لە تاقیگەی بایستراکچەری ئەستەربێری (زانکۆی لیدز، بەریتانیا) کۆکرانەوە. داتاکان لە دۆخی ژماردن بە گەورەکردنی 130 k کۆکرانەوە، و قەبارەی پێکسڵەکە بۆ 1.065 Å بە ژەمی 4.6 e-Å-2s-1 قەبارەکرا. فیلمەکە لە ماوەی ١٢ چرکەدا تۆمارکراوە و بەسەر ٤٨ بەشدا دابەشکراوە. بە گشتی 3359 فیلم کۆکرانەوە، بەهاکانی دیفۆکۆس لە نێوان -1 و -3μm.
هەموو پرۆسێسکردنی داتاکان لە بۆری Relion 3.0 ئەنجام دەدرێت (42). Motioncorr 2 (43) بەکاربهێنە بۆ ڕاستکردنەوەی جووڵەی تیشک بە کێشکردنی ژەمە دەرمانەکە، و پاشان CTFFIND 4.1 (44) بەکاربهێنە بۆ دیاریکردنی پارامێتری CTF (کارکردی گواستنەوەی کۆنتراست). فۆتۆمایکرۆگرافە ئاساییەکان دوای ئەم قۆناغە سەرەتاییانەی پرۆسێسکردن لە وێنەی 2 دا نیشان دراون. S16. قاڵبی هەڵبژاردنی ئۆتۆماتیکی بە هەڵبژاردنی دەستی نزیکەی 250 پێکسڵ لە 1000 تەنۆلکە لە چوارچێوەیەکی 250 پێکسڵ و هیچ پۆلێنبەندییەکی دوو ڕەهەندی (2D)ی ئاماژەپێکراو دروست دەکرێت، بەمەش ئەو پۆلێنکردنانە ڕەتدەکرێتەوە کە لەگەڵ پیسبوونی نمونەدا دەگونجێن یان هیچ تایبەتمەندییەکی دیاریان نییە. پاشان، هەڵبژاردنی ئۆتۆماتیکی لەسەر هەموو مایکرۆفۆتۆگرافەکان ئەنجامدرا، و RC-LH114-W 849,359 تەنۆلکە بوو، و کۆمپلێکسی RC-LH116 476,547 تەنۆلکە بوو. هەموو تەنۆلکە هەڵبژێردراوەکان دوو خولی پۆلێنکردنی دوو ڕوویی نائاماژەیان بەسەردا هاتووە، و دوای هەر ڕاکردنێک، ئەو تەنۆلکانەی کە ڕووبەری کاربۆن، پیسبوونی نمونە، هیچ تایبەتمەندییەکی دیار یان تەنۆلکەیەکی بەهێزی سەریەککەوتوو ڕەت دەکرێنەوە، لە ئەنجامدا 772,033 (90.9%) و 359,678 (75.5%) ) تەنۆلکەکان بۆ پۆلێنکردنی سێ ڕەهەندی بەکاردەهێنرێن RC-LH114-W و RC-LH116 بە ڕێککەوت. مۆدێلی سەرەتایی ئاماژەی سێ ڕەهەندی بە بەکارهێنانی ڕێگەی دابەزینی گرادێنت ستۆکاستیک دروستکرا. بە بەکارهێنانی مۆدێلی سەرەتایی وەک ئاماژەیەک، تەنۆلکە هەڵبژێردراوەکان لە چوار پۆلدا لە سێ ڕەهەندیدا پۆلێن دەکرێن. بە بەکارهێنانی مۆدێلی ئەم پۆلە وەک ئاماژەیەک، پاڵاوتنی سێ ڕەهەندی لەسەر تەنۆلکەکانی گەورەترین پۆل ئەنجام بدە، پاشان فلتەری سەرەتایی 15Å low-pass بەکاربهێنە بۆ داپۆشینی ناوچەی توێنەر، زیادکردنی 6 پێکسڵ لە لێوارە نەرمەکان، و دوای پرۆسێسکردنی پێکسڵەکان بۆ ڕاستکردنەوەی کارکردی گواستنەوەی لوتکەی Gatan K2 Modulation ی دۆزەرەوەی سەرەوە. بۆ کۆمەڵە داتاکانی RC-LH114-W، ئەم مۆدێلە سەرەتاییە دەستکاری کرا بە لابردنی چڕی بەهێز لە لێوارەکانی ماسکەکەدا (پەیوەندی بە چڕی ئاڵۆزی ناوەکی لە UCSF Chimera دابڕاوە). مۆدێلەکانی دەرەنجامی (ڕوونییەکانی RC-LH114-W و RC-LH116 بە ڕێککەوت 3.91 و 4.16 Åن) وەک ئاماژەیەک بۆ خولی دووەمی پۆلێنکردنی سێ ڕەهەندی بەکاردەهێنرێن. ئەو تەنۆلکانەی کە بەکاردەهێنرێن لە پۆلی سەرەتایی سێ ڕەهەندیدا گرووپ کراون و پەیوەندییەکی بەهێزیان لەگەڵ گەڕەکەکەدا نییە. سەریەککەوتن یان نەبوونی تایبەتمەندییە پێکهاتەییە دیارەکان. دوای خولی دووەمی پۆلێنکردنی سێ ڕەهەندی، ئەو پۆلە هەڵبژێردرا کە بەرزترین ڕوونی هەبوو [بۆ RC-LH114-W، پۆلێک 377,703 تەنۆلکە (44.5%)، بۆ RC-LH116، دوو پۆل هەیە، کە کۆی گشتی 260,752 تەنۆلکە (54.7%) , کە تەنها کاتێک یەکسانن دوای خولانەوەی سەرەتایی بە جیاوازییەکی کەمەوە]. تەنۆلکە هەڵبژێردراوەکان لە سندوقێکی ٤٠٠ پێکسڵدا دووبارە دەرهێنرێنەوە و بە پاڵاوتنی سێ ڕەهەندی پاڵاوتە دەکرێن. ماسکی توێنەر بە بەکارهێنانی فلتەری سەرەتایی 15Å low-pass، فراوانکردنی نەخشەی 3 پێکسڵ و ماسکی نەرمی 3 پێکسڵ دروست دەکرێت. بە بەکارهێنانی پاڵاوتنی CTF بۆ هەر تەنۆلکەیەک، ڕاستکردنەوەی جووڵەی هەر تەنۆلکەیەک و خولی دووەمی پاڵاوتنی CTF بۆ هەر تەنۆلکەیەک، پاڵاوتنی سێ ڕەهەندی، ماسکی توێنەر و دوای پرۆسێسکردن دوای هەر هەنگاوێک ئەنجام دەدرێت بۆ زیاتر پاڵاوتنی پێکهاتەی دەرەنجامی. بە بەکارهێنانی بەهای بڕینی FSC (رێژەی پەیوەندی توێکڵی فۆریەر) کە 0.143 یە، وردبینییەکانی مۆدێلی کۆتایی RC-LH114-W و RC-LH116 بە ڕێککەوت 2.65 و 2.80Åن. کێوی FSC ی مۆدێلی کۆتایی لە وێنەی 2 دا نیشان دراوە. S17.
هەموو زنجیرە پڕۆتینییەکان لە UniProtKB: LH1-β (PufB؛ UniProt ID: Q6N9L5) دابەزێنراون؛ LH1-α (PufA؛ UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL؛ ناسنامەی یونیپرۆت: O83005); RC-M (PufM؛ ناسنامەی یونیپڕۆت: A0A4Z7); RC-H (PuhA؛ ناسنامەی یونیپرۆت: A0A4Z9); پرۆتین-W (PufW؛ ناسنامەی یونیپرۆت: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) بەکارهات بۆ دروستکردنی مۆدێلێکی هاوشێوەیی RC، کە زنجیرە پڕۆتینییەکانی RC-L، RC-M و ​​RC-H و پێکهاتەی بلوری Rba لەخۆدەگرێت. sphaeroides RC وەکو قاڵبێک بەکارهات (PDB ID: 5LSE) (46). ئامرازی "نەخشەی گونجاندن" لە UCSF Chimera بەکاربهێنە بۆ گونجاندنی مۆدێلی دروستکراو لەگەڵ نەخشەی (47)، باشترکردنی پێکهاتەی پڕۆتین، و هاوفاکتەر [4×BChl a (ناوی پاشماوەی کتێبخانەی مۆنۆمەر = BCL)، 2×BPh a (BPH)، یەک یان دوو جۆری UQ10 (U10)، یەک ئاسنی نا-هیم (Fe) و یەک 3,4-dihydrohexacarbonylcholine (QAK)] Coot (48) بەکاربهێنە بۆ زیادکردن. بەو پێیەی QAK لە کتێبخانەی مۆنۆمەردا بەردەست نییە، بە بەکارهێنانی ئامرازی eLBOW لە PHENIX (49)دا پارامێتەر کرا.
دواتر ژێر یەکەی LH1 دروستکرا. سەرەتا، ئامرازی دروستکردنی ئۆتۆماتیکی لە PHENIX (49) بەکارهات بۆ دروستکردنی بەشێک لە زنجیرەی LH1 بە شێوەیەکی ئۆتۆماتیکی بە بەکارهێنانی نەخشەکە و زنجیرەکانی پڕۆتینی LH1-α و LH1-β وەکو زانیاری. تەواوترین ژێر یەکەی LH1 هەڵبژێرە، دەربهێنە و باری بکە بۆ ناو کووت، بە دەست زنجیرە ونبووەکەی ناوی زیاد بکە، و بە دەست تەواوی پێکهاتەکە پاڵاوتە بکە پێش زیادکردنی دوو BCls a (BCL) و spirilloxanthin (CRT) [بەپێی Rps پەیوەندیدار چڕی کۆمپلێکسی LH1 و ناوەڕۆکی کارۆتینۆید ناسراو. جۆرەکان (17)]. ژێر یەکە تەواوەکەی LH1 کۆپی بکە، و "ئامرازی نەخشەی دۆککردن"ی کایمێرای UCSF بەکاربهێنە بۆ جێگیرکردن لە ناوچەی نامۆدێلی تەنیشت چڕی LH1، و پاشان لە کووتدا پاڵاوتە بکە؛ پرۆسەکە دووبارە بکەرەوە تاوەکو هەموو ژێر یەکەکانی LH1 مۆدێل دەکرێن. بۆ پێکهاتەی RC-LH114-W، بە دەرهێنانی چڕی تەرخاننەکراو لە کووتدا، پڕۆتینەکە لە پێکهاتە ناپڕۆتینییەکانی ماوەتەوە لە نەخشەی USCF Chimera دابەش دەکرێت و ئامرازی Autobuild بەکاردەهێنرێت بۆ دامەزراندنی مۆدێلی سەرەتایی، و ژێر یەکەکانی دیکە (پڕۆتین-W) مۆدێلکردن. لە فینیکس (49). هەر زنجیرەیەکی ونبوو زیاد بکە بۆ مۆدێلی دەرەنجامی لە کووت (48)، و پاشان بە دەست تەواوی ژێر یەکەکە پاڵاوتە بکە. چڕی تەرخاننەکراوی ماوەتەوە لەگەڵ تێکەڵەی چەورییەکان (ID کتێبخانەی مۆنۆمێری PDB ی CDL = CDL، POPC = 6PL و POPG = PGT)، پاککەرەوەی β-DDM (LMT) و مۆلیکولەکانی UQ10 (U10) دەگونجێت. بەکارهێنانی باشترکردنی PHENIX (49) و باشکردنی دەستی لە Coot (48) بۆ تەواوکردنی مۆدێلی سەرەتایی تەواو تاوەکو ئاماری مۆدێلەکە و کوالیتی بینینی گونجانەکە ناتوانرێت زیاتر باشتر بکرێت. لە کۆتاییدا، LocScale (50) بەکاربهێنە بۆ تیژکردنەوەی نەخشەی ناوخۆیی، و پاشان چەندین خولی دیکەی مۆدێلکردنی چڕی تەرخاننەکراو و باشکردنی ئۆتۆماتیکی و دەستی ئەنجام بدە.
پێپتیدەکان، هاوفاکتەرەکان و چەوری و کوینۆنەکانی تر کە لە چڕییەکانیاندا جێگیر کراون لە وێنەکانی 1 و 2 دا نیشان دراون. S18 تا S23. زانیاری ئاماری مۆدێلی کۆتایی لە خشتەی S1 دا نیشان دراوە.
مەگەر بە پێچەوانەوە دیاری نەکرێت، سپێکتری مژینی UV/Vis/NIR لەسەر سپێکترۆفۆتۆمێتری Cary60 (Agilent، USA) لە نێوان 1 نانۆمەتر لە 250 نانۆمەتر بۆ 1000 نانۆمەتر و کاتی یەکگرتن 0.1س کۆکرایەوە.
نمونەکە لەناو کیوڤێتی کوارتزدا شل بکەرەوە بە ڕێڕەوی 2 ملم بۆ A880 لە 1، و سپێکتریمی مژینی لە نێوان 400 و 1000 نانۆمەتر کۆبکەرەوە. سپێکتری دوو ڕەنگی بازنەیی لەسەر سپێکترۆپۆلاریمێتەرێکی جاسکۆ 810 (جاسکۆ، ژاپۆن) لە نێوان 1 نانۆمەتر لە نێوان 400 نانۆمەتر و 950 نانۆمەتر بە ڕێژەی سکانکردنی 20 نانۆمەتر خولەک-1 کۆکرانەوە.
ڕێژەی لەناوچوونی مۆلی بە شلکردنەوەی کۆمپلێکسی ناوەکی بۆ A880 کە نزیکەی 50 بێت دیاری دەکرێت. قەبارەی 10μl لە 990μl بافەری بەستنەوە یان مێتانۆلدا شل بکەرەوە، و دەستبەجێ سپێکتریمی مژینی کۆبکەرەوە بۆ کەمکردنەوەی تێکچوونی BChl. ناوەڕۆکی BChl لە هەر نمونەیەکی مێتانۆل بە ڕێژەی لەناوچوون لە 771 نانۆمەتر لە 54.8 mM-1 cm-1 حیسابی بۆ کرا، و ڕێژەی لەناوچوون دیاری کرا (51). چڕیی BChl پێوراو دابەش بکە بەسەر 32 (RC-LH114-W) یان 36 (RC-LH116) بۆ دیاریکردنی چڕیی ئاڵۆزی ناوەکی، کە دواتر بەکاردەهێنرێت بۆ دیاریکردنی سپێکتریمی مژینی هەمان نمونە کە لە ڕێژەی لەناوچوونی بافەردا کۆکراوەتەوە. هاوتەریب. سێ پێوانە دووبارەبووەکان بۆ هەر نمونەیەک ئەنجامدرا، و تێکڕای مژینی زۆرترینی BChl Qy بۆ حیسابکردن بەکارهات. ڕێژەی لەناوچوونی RC-LH114-W کە لە 878 نانۆمەتر پێوراوە 3280±140 mM-1 cm-1 یە، لە کاتێکدا ڕێژەی لەناوچوونی RC-LH116 کە لە 880 نانۆمەتر پێوراوە 3800±30 mM-1 cm-1 یە.
UQ10 بەپێی شێوازی (52) ژمارەیی کرا. بە کورتی، HPLC قۆناغی پێچەوانە (RP-HPLC) بە بەکارهێنانی سیستەمی Agilent 1200 HPLC ئەنجامدرا. نزیکەی 0.02 نانۆمۆڵ RC-LH116 یان RC-LH114-W لە 50 میکرۆلیتر 50:50 مێتانۆل: کلۆرۆفۆرم کە 0.02% (ک/حەز) کلۆریدی فێریکی تێدایە بتوێنەوە، و دەرزیی پێشوەختە هاوسەنگکراوی Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 ملم بتوێنەرەوە لە 1 مل-1 خولەک-1 لە پلەی گەرمی 40 پلەی سەدی لە HPLC توێنەر (80:20 مێتانۆل:2-پرۆپانۆل) لەسەر ستوونی ×25 سم. شۆردنی ئایزۆکراتیک لە توێنەرێکی HPLC ئەنجام بدە بۆ چاودێریکردنی مژینی لە 275 نانۆمەتر (UQ10)، 450 نانۆمەتر (کارۆتینۆیدەکان) و 780 نانۆمەتر (BChl) بۆ ماوەی 1 کاتژمێر. لوتکەی کرۆماتۆگرامی 275 نانۆمەتر لە 25.5 خولەکدا یەکخراوە، کە هیچ پێکهاتەیەکی دیکەی دەستنیشانکراوی تێدا نەبوو. ڕووبەری یەکگرتوو بەکاردێت بۆ حیسابی بڕی مۆلی UQ10 کە دەرهێنراوە بە ئاماژەدان بە کێوی قەبارەدانان کە لە دەرزی لێدانی ستانداردە پاکەکان لە 0 بۆ 5.8 نانۆمۆڵ حیسابی بۆ کراوە (شێوەی S14). هەر نمونەیەک بە سێ دووبارەکردنەوە شیکرایەوە، و هەڵەی ڕاپۆرتکراو هاوتایە لەگەڵ SDی تێکڕا.
گیراوەیەک کە کۆمپلێکسی RC-LH1ی تێدایە کە زۆرترین مژینی Qy 0.1 بوو بە 30 میکرۆمۆلی کەمکراوەی سایتۆکرۆمی دڵی ئەسپ c2 (Merck، UK) و 0 بۆ 50 μMUQ2 (Merck، UK) ئامادەکرا. سێ نمونەی 1 مل لە هەر چڕیی UQ2 ئامادەکران و بۆ ماوەی شەوێک لە تاریکیدا لە پلەی گەرمی 4 پلەی سەدیدا کەرەوز کران بۆ دڵنیابوون لە گونجانی تەواو لەگەڵ تاریکیدا پێش پێوانەکردن. گیراوەکە لەناو سپێکترۆفۆتۆمێتری مۆدیۆلاری OLIS RSM1000 بارکرا کە بە تۆڕی 300 نانۆمەتر بڵێسە/500 هێڵی، 1.24 ملم هاتنە ژوورەوە، 0.12 ملم ناوەڕاست و 0.6 ملم دەرچەی دەرچوون تەیارکرابوو. فلتەرێکی تێپەڕبوونی درێژی 600 نانۆمەتر لە دەروازەی فۆتۆتیوبی نمونەیی و بۆری فۆتۆمالتیپلایەری ئاماژە دادەنرێت بۆ ئەوەی ڕووناکی وروژێنەر نەمێنێت. مژینی لە 550 نانۆمەتردا چاودێری کرا بە کاتی یەکخستنی 0.15 چرکە. ڕووناکی وروژاندن لە 880 نانۆمەتر M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) لە ڕێگەی کێبڵی فایبەر ئۆپتیکەوە بە چڕی 90% لە ڕێگەی کۆنترۆڵکەری DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) دەردەچێت و بە گۆشەی 90° of... تیشکی پێوانەکردن بەرامبەر ئاوێنە بۆ گەڕانەوەی هەر ڕووناکییەک کە لە سەرەتادا لەلایەن نمونەکەوە هەڵنەگیرابێت. چاودێری مژینی 10 چرکە پێش ڕووناکی 50 چرکە. پاشان زیاتر چاودێری مژینی کرا بۆ ماوەی 60 چرکە لە تاریکیدا بۆ هەڵسەنگاندنی ئەوەی کە تا چەند کوینۆلۆڵ لەخۆوە سایتۆکرۆمی c23 + کەمدەکاتەوە (بۆ زانیارییە خاوەکان سەیری وێنەی S8 بکە).
داتاکان بە جێگیرکردنی ڕێژەیەکی سەرەتایی هێڵی لە ماوەی 0.5 بۆ 10 چرکەدا (بەپێی چڕیی UQ2) و مامناوەندکردنی ڕێژەی هەر سێ نمونەکە لە هەر چڕیی UQ2دا پرۆسێس کران. چڕیی RC-LH1 کە بە ڕێژەی لەناوچوونی تایبەت بە خۆیان حیسابی بۆ کراوە بەکارهێنراوە بۆ گۆڕینی ڕێژەکە بۆ کارایی کاتالیتیک، لە Origin Pro 2019 (OriginLab، USA)دا نیشان دراوە، و لەگەڵ مۆدێلی Michaelis-Menten جێگیرکراوە بۆ دیاریکردنی بەهاکانی Km و Kcat کە دیارە.
بۆ پێوانەکانی مژینی ڕاگوزەر، نمونەی RC-LH1 شلکرایەوە بۆ ~2μM لە بافەری IMAC کە 50 میلی مۆلی ئەسکۆرباتی سۆدیۆم (مێرک، ئەمریکا) و 0.4 میلی مۆلی تێربوتین (مێرک، ئەمریکا)ی تێدابوو. ترشی ئەسکۆربیک وەک بەخشەری ئەلکترۆنی قوربانی بەکاردێت، و تێرت-بوتاکلۆفین وەک ڕێگریکەری QB بەکاردەهێنرێت بۆ دڵنیابوون لەوەی کە بەخشەری سەرەکی RC بە کەمبوونەوەی دەمێنێتەوە (واتە فۆتۆئۆکسید نەکراوە) بە درێژایی پرۆسەی پێوانەکردن. نزیکەی 3 مل نمونە زیاد دەکرێت بۆ خانەیەکی سووڕاوەی تایبەت (نزیکەی 0.1 م لە تیرە، 350 RPM) بە درێژی ڕێڕەوی بینایی 2 ملم بۆ دڵنیابوون لەوەی کە نمونەکە لە ڕێڕەوی لەیزەردا کاتێکی بەس هەیە بۆ گونجانی تاریکی نێوان پەلسی وروژاندن. پەلسی لەیزەری ~100-fs بەکاربهێنە بۆ گەورەکردنی سیستەمی لەیزەری Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) بۆ وروژاندنی نمونەکە لە 880 نانۆمەتر بە ڕێژەی دووبارەبوونەوەی 1 کیلۆهێرتز (20 nJ بۆ NIR یان 100 nJ بۆ Vis). پێش کۆکردنەوەی زانیاری، نمونەکە بخەرە بەر ڕووناکی وروژاندن بۆ ماوەی نزیکەی ٣٠ خولەک. بەرکەوتن دەبێتە هۆی ناچالاکبوونی QA (ڕەنگە جارێک یان دووجار QA کەم بکاتەوە). بەڵام تکایە ئاگاداربن کە ئەم پرۆسەیە دەگەڕێتەوە چونکە دوای ماوەیەکی زۆر لە گونجانی تاریک، RC هێواش هێواش دەگەڕێتەوە بۆ چالاکیی QA. سپێکترۆمێتری هێلیۆس (سیستەمەکانی ئۆلترافاست، ئەمریکا) بەکارهات بۆ پێوانەکردنی سپێکتری ڕاگوزەر بە کاتی دواکەوتنی -10 بۆ 7000 ps. نەرمەکاڵای Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) بەکاربهێنە بۆ هەڵوەشاندنەوەی کۆمەڵە داتاکان، پاشان تێکەڵکردن و ستانداردکردن. پاکێجی نەرمەکاڵای CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) بەکاربهێنە بۆ بەکارهێنانی کۆمەڵە داتا یەکگرتووەکان بۆ بەدەستهێنانی سپێکتری جیاوازی پەیوەست بە خراپبوونەوە، یان فەنکشنێک بەکاربهێنە کە چەندین ڕیزبەندی لەگەڵ وەڵامی ئامێرەکەدا دەگۆڕێت بۆ ئەوەی لەگەڵ پەرەسەندنی سپێکتراڵی تاکە درێژی شەپۆل لە Origin (OriginLab، USA)دا بگونجێت.
وەک لە سەرەوە باسمان کرد (53)، فیلمێکی فۆتۆسێنتێزی کە کۆمپلێکسی LH1ی تێدایە کە هەردوو ئەنتێنەی RC و LH2ی دەوروبەری تێدا نەبوو ئامادەکرا. پەردەکە لە 20 میلی مۆلی تریس (pH 8.0) شلکرایەوە و پاشان بارکرا بۆ ناو کوڤێتی کوارتز بە ڕێڕەوی بینایی 2 ملم. پەلسی لەیزەری 30nJ بەکارهات بۆ وروژاندنی نمونەکە لە 540 نانۆمەتر بە کاتی دواکەوتنی -10 بۆ 7000 ps. پرۆسێسکردنی کۆمەڵە داتاکان وەک ئەوەی بۆ Rps باسکراوە. نمونەی pal.
پەردەکە بە سەنتەرفۆجکردن لە 150,000 RCF بۆ ماوەی 2 کاتژمێر لە پلەی گەرمی 4 پلەی سەدیدا چەقۆی لێکرا، و پاشان هەڵمژینی لە 880 نانۆمەتردا لە 20 میلی مۆلی تریس-HCl (pH 8.0) و 200 میلی مۆلی NaCl هەڵواسرا. پەردەکە بتوێنەوە بە تێکەڵکردنی هێواش لە 2% (ک/ح) β-DDM بۆ ماوەی 1 کاتژمێر لە تاریکیدا لە پلەی گەرمی 4 پلەی سەدی. نمونەکە لە 100 میلی مۆلی کاربۆناتی ترای ئیتیلامۆنیۆم (pH 8.0) (TEAB؛ Merck، UK) شلکرایەوە بۆ چڕیی پڕۆتینی 2.5 میلیگرام مل-1 (شیکاری بایۆ-ڕاد). پرۆسێسی زیاتر لە ڕێگەی پێشتر بڵاوکراوە ئەنجامدرا (54)، سەرەتا بە شلکردنەوەی 50 میکرۆگرام پڕۆتین بۆ کۆی گشتی 50 میکرۆلیتر TEAB کە 1% (ک/ح) سۆدیۆم لۆراتی تێدایە (Merck, UK). دوای sonication بۆ ماوەی 60 s، کەمکرایەوە لەگەڵ 5 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine (Merck، UK) لە 37 °C بۆ ماوەی 30 خولەک. بۆ S-alkylation، نمونەکە لەگەڵ 10 mM میتیل S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) کەرەوز بکە و لە گیراوەی 200 mM ئایزۆپرۆپانۆل بۆ ماوەی 10 خولەک لە پلەی گەرمی ژووردا زیاد بکە. هەرسکردنی پرۆتۆلیتیک بە زیادکردنی 2 میکرۆگرام تێکەڵەی تریپسین/ئەندۆپڕۆتیناز Lys-C (Promega UK) ئەنجامدرا و لە پلەی گەرمی 37 پلەی سەدی بۆ ماوەی 3 کاتژمێر کەرەوز کرا. مادەی ڕووکار چالاککەری لۆرات بە زیادکردنی 50 میکرۆلیتر ئیتیل ئەسیتات و 10 میکرۆلیتر 10% (v/v) ترشی سێ فلۆرۆئەسیتیک پلەی LC (TFA؛ Thermo Fisher Scientific, UK) و گێژەڵوکە بۆ ماوەی 60 چرکە دەرهێنرا. جیاکردنەوەی قۆناغەکان بە سەنتەرفۆجکردن لە 15,700 RCF بۆ ماوەی 5 خولەک بەرەوپێش چوو. بەپێی پرۆتۆکۆڵی بەرهەمهێنەر، ستوونی خولگەی C18 (Thermo Fisher Scientific, UK) بەکارهێنرا بۆ هەڵمژینی و خوێکردنی ئەو قۆناغەی خوارەوە کە پێپتیدی تێدایە. پاش وشککردنەوە بە سەنتەرفۆجی بۆشایی، نمونەکە لە 0.5% TFA و 3% ئەسیتۆنیتڕیلدا تواوەتەوە، و 500 نانوگرەم بە کرۆماتۆگرافی نانۆفڵۆ RP شیکرایەوە کە لەگەڵ سپێکترۆمێتری بارستەیی جووتکرابوو بە بەکارهێنانی پارامێتەرەکانی سیستەم کە پێشتر بە وردی باسکراون.
بۆ ناسینەوەی پڕۆتین و ژماردن بۆ گەڕان بەدوای Rps، MaxQuant v.1.5.3.30 (56) بەکاربهێنە. بنکەدراوەی پرۆتۆئۆمی پالوستریس (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). داتاکانی پرۆتۆمیکی سپێکترۆمێتری بارستایی لە هاوپەیمانی ProteomeXchange لە ڕێگەی کۆگای هاوبەشی PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) لە ژێر ناسێنەری کۆمەڵە داتا PXD020402 دانراون.
بۆ شیکاری بە RPLC لەگەڵ سپێکترۆمێتری بارستەیی ئایۆنیزەکردنی ئەلکترۆسپرای، کۆمپلێکسی RC-LH1 لە جۆری کێوی Rps ئامادەکرا. بە بەکارهێنانی ڕێگەی پێشتر بڵاوکراوە (16)، چڕیی پڕۆتینی بەرهەم هێنراو لە خانەکانی پالوستریسدا 2 میلیگرام مل-1 بوو لە 20 میلی مۆلی Hepes (pH 7.8)، 100 میلی مۆلی NaCl و 0.03% (ک/ح) β- (شیکاری بایۆ-ڕاد) ) DDM. بەپێی پرۆتۆکۆڵی بەرهەمهێنەر، کیتی پاککردنەوەی دوو ڕوویی (GE Healthcare، ئەمریکا) بەکاربهێنە بۆ دەرهێنانی 10 میکرۆگرام پرۆتین بە شێوازی بارانبارین، و تواندنەوەی ڕەشبووەکە لە 20 میکرۆلیتر 60% (v / v) ترشی فۆرمیک (FA)، 20% (v / v) ئەسیتۆنیتڕیل و 20% (v/v) ئاو. پێنج مایکرۆلیتر بە RPLC (Dionex RSLC) شیکرانەوە لەگەڵ سپێکترۆمێتری بارستەیی (Maxis UHR-TOF، Bruker). ستوونی MabPac 1.2×100 ملم (Thermo Fisher Scientific، UK) بەکاربهێنە بۆ جیاکردنەوە لە پلەی گەرمی 60°C و 100μlmin -1، لەگەڵ گرادێنتێکی 85% (v/v) توێنەر A [0.1% (v / v) FA و 0.02% (V/v) گیراوەی ئاوی TFA] بۆ 85%(v/v) توێنەر B [0.1%(v/v) FA و 0.02%(v/v) لە 90%(v/v) ئەسیتۆنیتڕیل TFA] بە بەکارهێنانی سەرچاوەی ئایۆنیزەکردنی ئەلکترۆسپرای ستاندارد و پارامێتەرەکانی پێشوەختە بۆ زیاتر لە 60 خولەک، سپێکترۆمێتری بارستەیی 100 بۆ 2750 m/z (رێژەی بارستە بۆ بارگاویکردنەوە) بەدەست دەهێنێت. بە یارمەتی پۆرتاڵی سەرچاوەی بایۆئینفورماتیک ExPASy ئامرازی FindPept (https://web.expasy.org/findpept/)، نەخشەی سپێکتریمی بارستەیی بۆ ژێر یەکەکانی کۆمپلێکسەکە.
خانەکان بۆ ماوەی 72 کاتژمێر لە ژێر 100 مل NF-نزم (10μMm-2 s-1)، مامناوەند (30μMm-2 s-1) یان بەرز (300μMm-2 s-1) ڕووناکی گەشەیان پێدرا. ناوەندێکی M22 (ناوەندی M22 کە تێیدا سەلفات ئەمۆنیۆم لابراوە و سوکسیناتی سۆدیۆم بە ئەسیتاتی سۆدیۆم جێگەی دەگرێتەوە) لە شووشەیەکی 100 مل کە سەرەوەی پیچ (23). لە پێنج خولی 30 چرکەدا، 0.1 مایکرۆن کۆپەڵە شووشەییەکان بە ڕێژەی قەبارەی 1:1 کۆکرانەوە بۆ لایزەکردنی خانەکان و لەسەر سەهۆڵ بۆ ماوەی 5 خولەک ساردکرانەوە. ماددە نەتواوە، خانە نەشکاوەکان و کۆپەڵە شووشەییەکان بە سەنتەرفۆجکردن لە 16,000 RCF بۆ ماوەی 10 خولەک لە مایکرۆسەنتەرفۆجی بنچتۆپدا لابراون. پەردەکە لە ڕۆتۆرێکی Ti 70.1 لەگەڵ 100,000 RCF لە 20 mM tris-HCl (pH 8.0) لەگەڵ 40/15% (ک/ک) گرادێنتێکی ساکارۆز بۆ ماوەی 10 کاتژمێر جیاکرایەوە.
وەک لە کارەکانی پێشووماندا باسمان کرد، دۆزینەوەی بەرگری تاگی His لەسەر PufW (16). بە کورتی، کۆمپلێکسی ناوەکی پاککراوە (11.8 نM) یان ئەو پەردەیەی کە هەمان چڕیی RCی تێدایە (دیاری کراوە بە ئۆکساندن کەمکردنەوەی سپێکتریمی جیاوازی کەمبووەوە و هاوتاکردنی باری سەر جێڵی ڕەنگاوڕەنگ) لە 2x SDS بارگاویکردنەوە بافەر (Merck, UK) دوو جار شلکراوەتەوە. پڕۆتینەکان لەسەر جێڵی کۆپی 12% bis-tris NuPage جیاکرانەوە (Thermo Fisher Scientific, UK). جێڵێک بە Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) ڕەنگکرا بۆ بارکردن و بینینی ژێر یەکەی RC-L. پڕۆتینی سەر جێڵی دووەم گواسترایەوە بۆ پەردەی پۆلیڤینیلیدین فلۆرایدی چالاککراوی مێتانۆل (PVDF) (Thermo Fisher Scientific, UK) بۆ تاقیکردنەوەی بەرگری. پەردەی PVDF لە 50 mM tris-HCl (pH 7.6)، 150 mM NaCl، 0.2% (v/v) Tween-20 و 5% (w/v) شیری تۆزی بێ چەورکراو بلۆک کرا، و پاشان لەگەڵ دژەتەنی سەرەتایی دژە-His کەرەوز کرا (لە Dilute the antibody buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.6)، کەرەوز کرا، کێشرا. 150 میلی مۆلی NaCl و 0.05% (v/v) Tween-20] لە 1:1000 A190-114A، تاقیگەی بیتیل، ئەمریکا) بۆ ماوەی 4 کاتژمێر. پاش شۆردنی 3 جار بۆ ماوەی 5 خولەک لە بافەری دژەتەن، پەردەکە لەگەڵ دژەتەنی لاوەکی دژە مشک پەرۆکسیدایز (سیگما-ئەلدریچ، بەریتانیا) تێکەڵکرا (1:10,000 لە بافەری دژەتەندا شلکراوەتەوە) کەرەوزکرا بۆ ئەوەی ڕێگە بدرێت بە دۆزینەوە (5 خولەک دوای 3 شۆردن لە بافەری دژەتەن) بە بەکارهێنانی ژێرخانی WESTAR ETA C 2.0 کیمیایی ڕووناککردنەوە (سیاناجین، ئیتاڵیا) و ئەمێرشام ئیمەیجەر ٦٠٠ (جی ئێی هێڵت کەیر، بەریتانیا).
بە کێشانی دابەشبوونی چڕی هەر جێڵی ڕەنگاوڕەنگ یان هێڵی تاقیکردنەوەی بەرگری، یەکخستنی ناوچەی ژێر لوتکە و حیسابی ڕێژەی چڕی RC-L (جێڵی ڕەنگاوڕەنگ) و پڕۆتین-W (تاقیکردنەوەی بەرگری)، لە ImageJ (57) وێنەکە پرۆسێس بکە. ئەم ڕێژانە گۆڕدراون بۆ ڕێژەی مۆلی بە گریمانەکردنی ئەوەی کە ڕێژەی RC-L بۆ پڕۆتین-W لە نمونەی پاکی RC-LH114-W 1:1 بووە و بەپێی ئەوە تەواوی کۆمەڵە داتاکان ئاسایی کراوەتەوە.
بۆ زانیاری تەواوکەر بۆ ئەم بابەتە، تکایە سەیری http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 بکەن
ئەمە بابەتێکی دەستڕاگەیشتنێکی کراوەیە کە بەپێی مەرجەکانی مۆڵەتی ئیسباتکردنی کرێتیڤ کۆمۆن دابەشکراوە. بابەتەکە ڕێگە بە بەکارهێنان و دابەشکردن و بەرهەمهێنانەوەی بێ سنوور دەدات لە هەر میدیایەکدا بەو مەرجەی کە بەرهەمە ڕەسەنەکە بە شێوەیەکی دروست ئاماژەی پێکراوە.
تێبینی: تەنها داوات لێدەکەین ناونیشانی ئیمەیڵەکەت بدەیت بۆ ئەوەی ئەو کەسەی پێشنیاری دەکەیت بۆ پەیجەکە بزانێت کە تۆ دەتەوێت ئیمەیڵەکە ببینێت و سپام نییە. ئێمە هیچ ناونیشانێکی ئیمەیڵ ناگرین.
ئەم پرسیارە بەکاردێت بۆ تاقیکردنەوەی ئەوەی کە ئایا تۆ سەردانکەریت و ڕێگریکردن لە ناردنی سپام بە شێوەیەکی ئۆتۆماتیکی.
دەیڤید ج
پێکهاتەی ڕوونی بەرزی کۆمپلێکسی تەڵەی ڕووناکی 1 لە ناوەندی کارلێککردندا تێڕوانینێکی نوێ لە داینامیکی کوینۆن دەدات.
دەیڤید ج
پێکهاتەی ڕوونی بەرزی کۆمپلێکسی تەڵەی ڕووناکی 1 لە ناوەندی کارلێککردندا تێڕوانینێکی نوێ لە داینامیکی کوینۆن دەدات.
©2021 کۆمەڵەی ئەمریکی بۆ پێشخستنی زانست. هەموو مافەکان پارێزراوە. AAAS هاوبەشی کۆمپانیاکانی HINARI، AGORA، OARE، CHORUS، CLOCKSS، CrossRef و COUNTER ە. زانستی پێشکەوتن ISSN 2375-2548.